کروماتوگرافی ستونی – اصل، روش، کاربردها

کروماتوگرافی ستونی چیست؟

کروماتوگرافی ستونی به عنوان تکنیک مفیدی توصیف می‌شود که در آن موادی که قرار است جداسازی شوند در بالاترین نقطه ستونی که با یک جاذب بارگذاری شده است (فاز ثابت) ارائه می‌شوند و با سرعت‌های مختلف از ستون عبور می‌کنند که به میل ترکیبی هر ماده بستگی دارد. جاذب و حلال یا مخلوط حلال، و معمولاً هنگام عبور از ستون در زمان های مختلف در محلول جمع می شوند.

دو نمونه رایج از فازهای ثابت برای کروماتوگرافی ستونی سیلیکاژل و آلومینا هستند در حالی که حلال های آلی به عنوان رایج ترین فازهای متحرک در نظر گرفته می شوند.

اصل کروماتوگرافی ستونی

اصل اصلی در کروماتوگرافی ستونی، جذب املاح محلول با کمک یک فاز ساکن و سپس جداسازی مخلوط به اجزای مستقل است.

در نقطه ای که فاز متحرک همراه با مخلوطی که نیاز به جداسازی دارد از بالای ستون وارد می شود، حرکت تک تک اجزای مخلوط با سرعت های مختلفی انجام می شود.

اجزایی که جذب و میل ترکیبی کمتری نسبت به فاز ساکن دارند، در مقابل جذب بیشتر و میل ترکیبی با فاز ساکن، سریع‌تر خارج می‌شوند. اجزایی که به سرعت حرکت می کنند ابتدا از طریق اجزایی که به آرامی حرکت می کنند خارج می شوند و در آخر شسته می شوند.

جذب مولکول های املاح به ستون به صورت برگشت پذیر اتفاق می افتد. سرعت حرکت اجزا به صورت زیر اعلام می شود:

R_f = the distance traveled by solute/ the distance traveled by the solvent

Where R_f is called retardation factor

نمودار کروماتوگرافی ستونی 

اجزای کروماتوگرافی ستونی

اجزای یک سیستم کروماتوگرافی معمولی با استفاده از فاز متحرک گاز یا مایع عبارتند از:

• فاز ثابت –به طور کلی یک ماده جامد است که خاصیت جذب خوبی دارد و باید برای جدا بودن آنالیت ها مناسب باشد. نباید مانعی در جریان فاز متحرک ایجاد کند.

• فاز سیال و سیستم تحویل –این فاز از حلال هایی تشکیل شده است که مکمل فاز ساکن هستند.

فاز متحرک به عنوان یک حلال، یک عامل توسعه دهنده (جداسازی اجزای نمونه را برای تشکیل نوارها ترویج می کند)، و یک عامل شستشو (برای حذف اجزایی از ستون که در طول آزمایش جدا شده اند) عمل می کند.

• ستون –

برای کروماتوگرافی مایع:2-50 سانتی متر طول و 4 میلی متر قطر داخلی، ساخته شده با فولاد ضد زنگ

برای کروماتوگرافی گازی:1-3 متر طول و 2-4 میلی متر قطر داخلی، ساخته شده با شیشه یا فولاد ضد زنگ

مواد یک ستون و ابعاد آن برای پشتیبانی از فاز ثابت و ارتقای جداسازی موثر بسیار حیاتی است.

• سیستم انژکتور –مسئول تحویل نمونه های آزمایشی به بالای ستون با الگوی تکرارپذیر.

• آشکارساز و ضبط نمودار –این یک رکورد پیوسته از حضور آنالیت ها در محلول شوینده را هنگامی که از ستون خارج می شوند به دست می دهد. تشخیص به اندازه گیری یک پارامتر فیزیکی (مانند جذب مرئی یا UV) متکی است. در ضبط کننده نمودار، هر آنالیت جدا شده با نشان داده می شود. اوج.

یک کلکتور در پایین در انتهای پایین ستون قرار داده شده است تا آنالیت های جدا شده را جمع آوری کند.

روش کروماتوگرافی ستونی

مراحل موجود در کروماتوگرافی ستونی عبارتند از:

1. آماده سازی ستون

• ستون عمدتاً از یک لوله شیشه ای با فاز ثابت مناسب تشکیل شده است
• انتهای پایین ستون با یک پشم شیشه / پشم پنبه یا یک پد آزبست بسته بندی شده است که پس از آن فاز ثابت بسته بندی می شود.
• پس از بسته بندی ستون، یک دیسک کاغذی در بالا قرار داده می شود تا از اختلال در فاز ساکن در هنگام معرفی نمونه یا فاز متحرک جلوگیری شود. اختلال در فاز ساکن (لایه جاذب) منجر به باندهای جداسازی نامنظم می شود.

دو نوع آماده سازی ستون که به عنوان تکنیک های بسته بندی شناخته می شوند عبارتند از:

1. تکنیک بسته بندی خشک –مقدار جاذب مورد نیاز به صورت پودر خشک ریز در ستون اضافه می شود و حلال آزادانه در ستون جریان می یابد تا زمانی که تعادل حاصل شود.
2. تکنیک بسته بندی مرطوب –دوغاب جاذب همراه با فاز متحرک تهیه شده و در ستون ریخته می شود و به عنوان روشی ایده آل برای بسته بندی در نظر گرفته می شود.

ستون باید قبل از استفاده به خوبی شسته و کاملاً خشک شود.

1. معرفی نمونه

• نمونه (مخلوطی از اجزاء) در حداقل مقدار فاز متحرک حل می شود.
• در یک لحظه نمونه وارد ستون شده و در قسمت بالایی ستون جذب می شود.
• از طریق فرآیند شستشو، نمونه فردی را می توان از این منطقه جدا کرد.

1. شستشوی فنی

از طریق این تکنیک، اجزای جداگانه به طور کامل از ستون جدا می شوند.

فرآیند شستشو را می توان با استفاده از دو تکنیک انجام داد:

1. روش شستشوی ایزوکراتیک – در طول روش، از حلالی با قطبیت یکسان یا ترکیب حلال مشابه استفاده می شود.

مثال: استفاده از کلروفرم به تنهایی

1. تکنیک شستشوی گرادیان – در طول فرآیند جداسازی، از حلال هایی با قطبیت افزایش یافته یا افزایش قدرت شستشو استفاده می شود.

مثال: بنزن → کلروفرم → اتیل استات → کلروفرم

1. تشخیص مولفه ها

• در صورتی که مخلوط جدا شده در روش کروماتوگرافی ستونی ترکیبات رنگی باشد، نظارت بر پیشرفت جداسازی ساده است.
• در صورتی که ترکیبات در حال جداسازی بی رنگ باشند، بخش های کوچکی از مایع شوینده به ترتیب در لوله هایی که برچسب گذاری شده اند جمع آوری می شوند. از طریق TLC، ترکیب هر بخش تعیین می شود.

انواع کروماتوگرافی ستونی

1. کروماتوگرافی ستونی جذب –تکنیک جداسازی که در آن ترکیباتی که قرار است جدا شوند (املاح) روی سطح جاذب حفظ یا جذب می شوند (فاز ساکن).
2. کروماتوگرافی ستون پارتیشن –این بر اساس واریانس در ضریب تقسیم اجزای جداگانه مخلوط است، که در آن فاز ساکن و فاز متحرک هر دو در حالت مایع هستند.
3. کروماتوگرافی ستونی ژل –در اینجا، جداسازی از طریق یک ستون مملو از ژل و دارای یک فاز ثابت متخلخل انجام می شود. همچنین به آن کروماتوگرافی حذف اندازه نیز گفته می شود
4. کروماتوگرافی ستون تبادل یونی –پایه به بار مولکول ها متکی است. جداسازی زمانی انجام می شود که مولکول ها به فاز ثابت با بار مخالف جذب شوند.
5. کروماتوگرافی گازی (GC)
6. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

موارد استفاده از کروماتوگرافی ستونی

کروماتوگرافی ستونی یکی از روش های همه کاره برای خالص سازی و جداسازی جامدات و مایعات است.

کاربردهای عمده:

1. برای جداسازی اجزای فعال
2. برای جدا کردن مخلوط های مرکب
3. برای حذف ناخالصی ها یا انجام فرآیند تصفیه
4. برای جداسازی متابولیت ها از مایعات بیولوژیکی
5. برای تخمین داروها در فرمولاسیون دارویی یا عصاره های خام

منابع:

1. http://www.rnlkwc.ac.in/pdf/study-material/physiology/column%20chromatography.pdf
2. https://www.biomadam.com/types-of-column-chromatography
3. https://microbenotes.com/column-chromatography/