انواع فازهای ساکن ستون HPLC

“تحصیلات رسمی کمک می­کند امرار معاش کنید، ولی آموزش­های شخصی شما را ثروتمند می­کند.”

جیم ران

در بخش 1، قیاسی انجام شد که مخلوط مولکولی را به خانواده­ای شبیه می­دانست که در حال عبور از یک مغازه­ی آبنبات­ فروشی (فاز ساکن) هستند. از آنجا که کودکان به آب­نبات علاقه دارند مایل­ند در آنجا بمانند، در حالی که والدین مانند مولکول­های نگه داشته نشده به حرکت خود ادامه می­دهند که منجر به جداشدن فرزندان از والدین می­شود! جزءبندی مولکول­های نمونه میان فاز متحرک و فاز ساکن در ستون HPLC  بر اساس میل­ های ترکیبی­ ای است که برخی از مولکول­ها را عقب نگاه می­دارد، در حالی که به باقی آنها اجازه می­دهد تا آزادانه عبور کنند.

فاز ساکن ستون HPLC جایی است که جداسازی در آن رخ می­دهد و مهم­ترین بخش سیستم است. انواع مختلف تجزیه و تحلیل، بر اساس نوع فاز ساکن و مکانیسم جداسازی در ستون طبقه­ بندی می­شوند.

اساساً تعاملات بر سه نوع است:

• تعاملات قطبی

اختلاف در قطبیت میان اجزای نمونه و ماهیت­های پیوندی در فاز ساکن، که به بازداری ترجیحی منجر می­شود.

• تعاملات یونی

جداسازی بر اساس ویژگی­های بار مولکول­های نمونه. یون­ های آنالیت به مراکز یونی با بار مخالف در فاز ساکن تمایل دارند.

• اندازه­ ی مولکولی

جداسازی به علت گیرانداختن مولکول­های کوچک در منافذ فاز ساکن رخ می­دهد. ابتدا مولکول­های بزرگ عبور می­کنند و سپس مولکول­های کوچک­تر که گیر افتاده ­اند، شسته می­شوند.

اکنون ما به طور خلاصه انواع جداسازی HPLC را بر اساس چنین تعاملاتی مورد بحث قرار می­دهیم.

جداسازی HPLC فاز معکوس

اغلب کاربردهای HPLC تحت کروماتوگرافی فاز معکوس قرار می­گیرند. فازهای ساکن غالباً از هیدروکربن ­های آلکیل غیرقطبی مانند زنجیره­های C-8 یا C-18 تشکیل شده اند که به سیلیس یا سایر تکیه­ گاه­ های بی­ اثر متصل شده اند. ستون­های C18 در حقیقت می­­توانند بیش از 60%  از کاربردهای مورد نیاز در اغلب آزمایشگاه­های HPLC را برآورده کنند. فاز متحرک قطبی است و ترتیب شویش بر اساس ترکیبات قطبی، و سپس ترکیباتی با قطبیت کمتر و در انتها ترکیباتی با قطبیت ضعیف یا غیر قطبی است.

جداسازی HPLC فاز نرمال

جداسازی­ فاز نرمال، معکوس جداسازی فاز معکوس است. فازهای ساکن قطبی بوده و از سیلیس ساده یا ترکیبات آلی مانند آمینو، سیانو و غیره تشکیل شده اند، یعنی گروه هایی که به تکیه­ گاه­ های مبتنی بر سیلیس متصل شده اند. فازهای متحرک غیرقطبی هستند، مانند هگزان، هپتان و غیره، با مقادیر کمی از تعدیل­ کننده­ های قطبی مانند متانول، اتانول، ایزوپروپانول و غیره. ترتیب شویش بر اساس مولکول­های غیرقطبی، و سپس مولکول­هایی با قطبیت ضعیف و در انتها مولکول­های قطبی است.

کروماتوگرافی تبادل یونی

معمولاً از رزین­ های آلی مصنوعی یا ترکیبات قابل یونیزاسیون محلول در آب برای جداسازی استفاده می­شود. مبدل­های آنیونی دارای مراکز مثبت در سطح خود هستند و برای جداسازی ترکیبات حاوی گروه­های سولفونات، فسفات یا کربوکسیلات استفاده می­شوند. مبدل­های کاتیونی دارای مراکز منفی در سطح خود هستند و برای جداسازی ترکیبات پایه مانند آمین­ها استفاده می­شوند. استایرن دی وینیل بنزن با اتصالات عرضی، یک ماده­ ی پایه­ ی معمولی با گروه­های بارداری است که به حلقه­ های فنیل متصل شده اند. بارهای روی مواد پُرکننده، مولکول­هایی با بار مخالف را از فاز متحرک جذب می­کنند و آنها را با ترتیبِ معکوس نیروهای جاذبه آزاد می­کنند. جداسازی اجزا را می­توان با کنترل pH فاز متحرک، دما، ترکیب یونی و افزودن تعدیل ­کننده­ ها کنترل کرد.

کروماتوگرافی اندازه طردی

جداسازی بر اساس اندازه­ ی مولکولی مولکول­ ها صورت می­گیرد. مولکول­های کوچک در منافذ فاز ساکن گیر افتاده و پس از مولکول­های بزرگ خارج می­شوند. هیچ نیروی شیمیایی یا یونی در فرایند جداسازی دخیل نیست. چنین فازهایی با بنیان­ های سیلیس یا زیرکونیوم و پلیمرهایی با اتصالات عرضی سنگین در دسترس هستند و برای جداسازی مولکول­های بزرگی مانند پلی­ ساکاریدها، پپتیدها، پروتئین­ها و پلیمرها استفاده می­شوند.

طول ستون با فاز ساکنِ یکسان تأثیر قابل توجهی بر فرآیند جداسازی دارد. ستون­های عریض و طویل می­توانند بارهای بیشتری از نمونه را در خود جای داده و تفکیک­ پذیری بالاتری را ارائه دهند. از سوی دیگر، ستون­های کوتاه­تر زمان آنالیز و در نتیجه مصرف فاز متحرک را کاهش می­دهند.

پس از شناخت فاز ساکن، لازم است فاز متحرک را شناخت که اساساً برای حمل نمونه در سیستم HPLC  مورد استفاده قرار می­گیرد.

نکته­

هرگز از ستون به عنوان همزن استفاده نکنید و مراقب باشید تا در معرض شوک مکانیکی قرار نگیرد، زیرا در این صورت ممکن است عمل پُرکردن ستون به طور برگشت­ ناپذیری مختل شود.

بخش بعدی انواع فازهای متحرک را به شما معرفی می­کند.

جهت مشاوره و خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی با مشاوران واحد فروش شرکت شناسا پرتوژن ۷۵۳۱۱ – ۰۲۱ در ارتباط باشید.