مبانی کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

---

مقدمه ای بر HPLC

---

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) فرآیند جداسازی اجزا در یک مخلوط مایع است. یک نمونه مایع به یک جریان حلال (فاز متحرک) تزریق می شود که از طریق یک ستون بسته بندی شده با یک محیط جداسازی (فاز ثابت) جریان می یابد. اجزای نمونه در حین عبور از ستون با فرآیند مهاجرت تفاضلی از یکدیگر جدا می شوند.

همانطور که نوارها از ستون بیرون می آیند، جریان آنها را به یک یا چند آشکارساز می برد که یک پاسخ ولتاژ را به عنوان تابعی از زمان ارائه می دهد. به این کروماتوگرام می گویند. برای هر پیک، زمانی که در آن پدیدار می شود، جزء نمونه را با توجه به یک استاندارد مشخص می کند. مساحت قله نشان دهنده کمیت است.

 

اجزای اصلی سیستم HPLC

---

 

 

گاز زدا حلال– گازهای هوا را از حلال ها در حین جریان به پمپ HPLC حذف می کند

پمپ HPLC– جریان حلال و تناسب را فراهم می کند

نمونه گیری خودکار (اتوسمپلر)– نمونه هایی را از ویال ها می گیرد و به جریان حلال ارائه شده توسط پمپ تزریق می کند.

آشکارساز(دتکتور)– به آنالیت های جدا شده از ستون HPLC پاسخ می دهد و یک سیگنال خروجی برای نرم افزار تولید می کند.

آون ستون– ستون HPLC را در خود جای داده و دمایی را برای جداسازی های تکرارپذیر حفظ می کند

 

حالت های شستشوی ایزوکراتیک در مقابل گرادیان

---

شستشوی ایزوکراتیک

• یک ترکیب واحد از حلال ها برای مدت زمان جداسازی استفاده می شود
• پیک های شستشوی دیرتر به دلیل پراکندگی وسیع تر از پیک های شستشوی اولیه هستند
• باید اقداماتی برای شستشوی دوره‌ای ستون با قدرت حلال بالاتر انجام شود تا آن را از مواد غیرقابل تحملی که در اثر تزریق نمونه ایجاد می‌شود پاکسازی کند.

 

شستشوی گرادیان

• ترکیب حلال ها به صورت پیوسته یا گام به گام تغییر می کند
• به طور کلی، قله ها در سراسر کروماتوگرام در مقایسه با شستشوی ایزوکراتیک تیزتر هستند
• برخی از جداسازی ها ممکن است به دست آید که با استفاده از شستشوی ایزوکراتیک امکان پذیر نیست
• زمان اجرای کروماتوگرام ممکن است در مقایسه با شستشوی ایزوکراتیک کوتاهتر باشد

 

حالت های پمپاژ شستشوی ایزوکراتیک و گرادیان

---

پمپ ایزوکراتیک

پمپ تک کانالی که کاربر را ملزم می کند فاز متحرک را از قبل مخلوط کند. ترکیب با گذشت زمان ثابت می ماند.

 

پمپ گرادیان کم فشار کواترنر

یک پمپ 4 کانالی که مخلوطی از کانال های حلال جداگانه را تحت کنترل نرم افزار ایجاد می کند. مخلوط کردن قبل از سر پمپ انجام می شود. ترکیب ممکن است با گذشت زمان تغییر کند.

 

پمپ گرادیان فشار بالا باینری

یک پمپ 2 کاناله که مخلوطی از 2 حلال را تحت کنترل نرم افزار ایجاد می کند. اختلاط پس از سر پمپ انجام می شود. ترکیب ممکن است با گذشت زمان تغییر کند.

 

ستون LC توصیه شده:

شیمی ستون: به عنوان مثال C18، C8، C4، فنیل-هگزیل، فرمت ستون بی فنیل: 100 x 3 میلی متر، ذرات 2.7 تا 5 میکرومتر

برنامه پمپ Shimadzu LabSolutions – گرادیان غربالگری

 

گرادیان غربالگری – قدرتمند برای توسعه روش

---

تفسیر: برای ستون LC فاز معکوس که در آن A آب است و B آلی است، این اولین اجرا اجزای نمونه را نشان می دهد که همه قطبی هستند. بنابراین، جداسازی ضعیف است زیرا مواد در فاز ثابت تقسیم کمی را تجربه می کند. به عبارت دیگر، شرایط حلال ضعیف و در شروع، ترکیبات نمونه را خیلی زود از بین می‌برد.

برای اینکه مواد بیشتر به فاز ساکن تقسیم شوند، شیب گرادیان را کاهش می دهیم تا استحکام فاز متحرک به سرعت افزایش پیدا نکند. مواد برای مدت طولانی تری باقی می مانند و شروع به جدا شدن از یکدیگر می کنند. توجه داشته باشید که ما همچنان ستون را با حلال قوی در پایان اجرا می‌شوییم تا به طور موثر ستون را تمیز کنیم.

ما شیب گرادیان را دوباره کاهش می دهیم تا زمانی که شروع به دیدن یک جداسازی خوب در بازه زمانی کنیم.

آشکارسازهای موجود برای HPLC

---

آشکارسازهای UV/Vis

• به آنالیت های کروموفوریک در محدوده 190 تا 800 نانومتر پاسخ می دهد
• مانیتورینگ تک طول موج
• برای اکثر آنالیت های آلی خوب است
• شستشوی گرادیان سازگار است

 

آشکارسازهای فتودیود آرایه (PDA)

• به آنالیت های کروموفوریک در محدوده 190 تا 800 نانومتر پاسخ می دهد
• مانیتورینگ چند طول موجی
• پروفایل طیفی کامل پیک های کروماتوگرافی
• برای اکثر آنالیت های آلی خوب است
• شستشوی گرادیان سازگار است

 

آشکارسازهای فلورسانس (FLD)

• فقط به آنالیت هایی پاسخ می دهد که به طور طبیعی فلورسانس می کنند یا می توان آنها را از طریق مشتق سازی فلورسانس کرد.
• فوق العاده حساس
• شستشوی گرادیان سازگار است

 

آشکارسازهای ضریب شکست(RID)

• یک آشکارساز جهانی برای همه آنالیت ها در نظر گرفته شده است
• نسبتاً غیر حساس
• با شستشوی گرادیان سازگار نیست

 

آشکارسازهای پراکندگی نور تبخیری

• یک آشکارساز تقریباً جهانی در نظر گرفته می شود که به آنالیت های کروموفوریک و غیرکروموفوریک پاسخ می دهد.
• حساسیت خوب
• شستشوی گرادیان سازگار است

 

آشکارسازهای طیف سنجی جرمی(MS)

• متمایزترین آشکارساز
• اطلاعات انبوه را برای شناسه آنالیت و توضیح ساختار ارائه می دهد
• بسیار حساس
• شستشوی گرادیان سازگار است

 

ستون های HPLC

---

ستون های HPLC با ذرات سیلیس متخلخل بسته بندی شده اند.

ملاحظات هنگام انتخاب ستون

تصمیم “بهترین” فاز ثابت برای جداسازی باید بر اساس حلالیت نمونه و تفاوت های شیمیایی بین اجزای نمونه باشد.

• محلول در حلال های آلی یا آبی؟
• آشنایی با گروه های عملکردی تشکیل دهنده؟ -اوه -COOH -CONH2; -C6H6 و غیره

 

تصمیم گیری در مورد ابعاد ستون باید بر اساس اهداف کروماتوگرافی باشد.

• تفکیک یک جفت مهم از مؤلفه ها؟ – بستر ستونی بلندتر
• تجزیه و تحلیل سریع؟ – بستر ستون کوتاه تر
• حداکثر وضوح برای همه؟ – ذرات کوچکتر
• مصرف حلال را به حداقل برسانید؟ – قطر داخلی باریکتر

 

شیمی فازهای پیوندی

---

 

بسته بندی فاز پیوندی با سطح سیلیسی خالی شروع می شود

از طریق واکنش شیمیایی، اتصال فاز پیوند اولیه حاصل می شود.

تولیدکنندگان به میزان پوشش فاز پیوندی بر حسب درصد بار کربن اشاره می کنند.

بیشتر سطح سیلیس بدون واکنش باقی می ماند – برخی از گروه های سیلانول سطحی هنوز در معرض قرار دارند.

اغلب، یک مرحله پیوند ثانویه، مولکول‌های کوچک‌تر «درپوش انتهایی» را بین رشته‌های فاز باند اولیه وارد می‌کند. این درپوش های انتهایی ممکن است قطبی یا غیر قطبی باشند.

ستون‌های مختلف از یک نوع فاز پیوندی از نظر قرار گرفتن در معرض سیلانول و پوشش انتهایی متفاوت خواهند بود، که منجر به طیفی از قطبیت‌های کلی مختلف و توانایی جداسازی متفاوت می‌شود.

C18

C8

 

 

شیمی فاز پیوندی مشترک

---

فنیل

 

بی فنیل

 

آلکیل آمید

 

سیانو پروپیل

 

 

پنتافلوروفنیل پروپیل

 

آمینو پروپیل

 

 

انتخاب های شیمی ستون بر اساس حلالیت نمونه

---

 

پدیده احتباس آبگریز

---

ستون‌های فاز معکوس دارای فاز پیوندی روی سطح ذرات سیلیس هستند که ماهیت آبگریز دارد. به عنوان مثال می توان به C30، C18، C8، C4 اشاره کرد.

در اصل، “مانند، مانند را تجزیه می کند”. چنین ستونی تمایل به حفظ اجزای نمونه را دارد که آبگریز نیز هستند، تا زمانی که فاز متحرک در جذب آن برای آن جزء نمونه قوی‌تر نباشد. اجزای نمونه قطبی بیشتر تمایل دارند سریعتر از ستون خارج شوند زیرا به میزان کمتری حفظ می شوند.

برای یک ستون فاز معکوس، از ترکیبی از حلال‌ها استفاده کنید که قطبیت کلی «بزرگ‌تر» (کمتر آبگریز) را نسبت به فاز ساکن ایجاد می‌کنند. به این ترتیب، اجزای نمونه دلیلی برای جذب شدن به فاز ساکن (فاز باند ستونی) و مقاومت در برابر تمایل به جریان با فاز متحرک (حلال) دارند.

از “ضعیف ترین” یا قطبی ترین شرط لازم برای تمایز بین اجزای نمونه در حین عبور از ستون استفاده کنید.

نمونه هایی از جفت حلال های رایج فاز متحرک عبارتند از: استونیتریل/آب و متانول/آب. تغییر نسبت آلی/آب قطبیت کلی آن را تغییر می دهد.

 

نمونه ای از احتباس آبگریز

---

مولکول های زیر به راحتی روی ستون C8 فاز معکوس با استفاده از 50/50 استونیتریل/آب جدا می شوند. آلانین قطبی ابتدا از ستون و سپس ترفنیل غیر قطبی شسته می شود.

1,1′:3′,1”-terphenyl hydrophobic or non-polar

alanine hydrophillic or polar