آنالیز ملامین و مواد مرتبط در کودها با دستگاه HPLC

سیانامید کلسیم یک کود نیتروژن چند منظوره است که به عنوان یک آفت کش و اصلاح کننده خاک نیز موثر است. با اطمینان از تامین نیتروژن گیاهان، نقش مهمی در کشت محصولات دارد. اخیراً سطوح بالایی از ملامین به عنوان یک محصول جانبی در برخی از محصولات هیدرات کلسیم سیانامید کشف شده است که با آب اضافه شده پلت شده است. با توجه به خطر جذب ملامین از خاک توسط محصولات کشاورزی، به عنوان یک خطر بالقوه برای سلامت عمومی شناخته شده است.

مسائل بهداشتی مرتبط با ملامین از زمان رسوایی شیر چین در سال 2008 مورد توجه عموم قرار گرفته است.استفاده یک پیش ماده به طور گسترده برای بسیاری از کاربردها از یک سو و آلودگی آن برای خوراک و شیر از سوی دیگر، استفاده از آن در کود نیز می تواند شناخت عامل را تسهیل کند. ملامین وارد زنجیره غذایی می شود. مواجهه طولانی مدت با ملامین و ماده مرتبط با آن، اسید سیانوریک، از طریق مصرف می تواند منجر به سنگ مثانه یا کلیه شود که در نهایت می تواند منجر به سرطان مثانه شود غلظت این ترکیب در غذا و خوراک باید به دقت کنترل شود. دفتر ایمنی مواد غذایی و امور مصرف کنندگان در وزارت کشاورزی، جنگلداری و شیلات ژاپن با صدور اطلاعیه ای حداکثر غلظت مجاز موقت ملامین را در سیانامید کلسیم 0.4% مشخص کرد. یک روش ساده و قوی برای آماده سازی نمونه و آنالیز ملامین و مواد مرتبط، یعنی آملین، آملید و اسید سیانوریک در کود، که با استفاده از HPLC با دتکتور UV انجام و نشان داده شده است. پنج محصول مورد بررسی قرار گرفتند که به صورت تجاری در ژاپن موجود بودند، یعنی Nitrolime 1، Nitrolime 2، کودهای مصنوعی (x2) و سولفات آمونیوم.

مواد و روش ها

سنتز ملامین می تواند با جایگزینی گروه آمینه ‘-NH2’ در موقعیت های R1-R3 با یک گروه هیدروکسی ‘-OH’ منجر به تعدادی از محصولات جانبی شود. ساختار ملامین و مواد مرتبط با آن در شکل 1 نشان داده شده است. تجزیه و تحلیل همزمان ترکیبات مورد نظر با استفاده از یک سیستم HPLC Shimadzu Prominence™ متشکل از یک واحد گاززدایی DGU-20A، یک پمپ LC-20AD، یک دستگاه اتوسمپلر SIL-20ACHT  یک آون CTO-20AC و یک آشکارساز UV SPD-20A انجام شد. جداسازی کروماتوگرافی با استفاده از ستون TSKgel® Amide-80 (250 میلی متر L. x 4.6 میلی متر ID، 5 میکرومتر) در دمای 40 درجه سانتی گراد انجام شد. شرایط تحلیلی بیشتر در جدول 1 مشخص شده است.

آماده سازی نمونه

نمونه‌های کود مورد آزمایش مطابق با روش‌های آزمایش کود آماده شدند . پانصد نمونه کود در یک ارلن توزین شده و در حمام اولتراسونیک به مدت 30 دقیقه با استفاده از مخلوط اسید هیدروکلریک / آب (1:15 v/v) استخراج شد. سپس نمونه ها در 2000 xg به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند و 5 میلی لیتر از مایع رویی به یک فلاسک حجمی 50 میلی لیتری منتقل شد و با مخلوطی از بافر استونیتریل/فسفات (4:1 v/v) به حجم رقیق شد. مقدار کمی از نمونه رقیق دوباره در 8000 xg به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی برای تجزیه و تحلیل به ویال HPLC منتقل شد.

نتایج

کروماتوگرام مخلوط استاندارد حاوی ملامین و مواد مرتبط با آن (هر یک میلی گرم در لیتر) در شکل 3 نشان داده شده است. محدوده منحنی های کالیبراسیون برای هر ترکیب از 05/0 تا 5 میلی گرم در لیتر می باشد. نتایج خطی بودن خوبی را نشان می‌دهند، با R2 ≥ 0.9999. انحراف استاندارد نسبی (% RSD) برای هر ناحیه پیک از شش آنالیز متوالی به ترتیب 0.41% برای اسید سیانوریک، 0.42% برای آملید، 0.52% برای ملامین و 0.56% برای آملین بود.
پنج نوع کود مختلف همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر ترکیبات هدف به دست آمده در نمونه های ارزیابی شده تقریباً 0.035 تا 2.8% w/w ملامین، 0.035 تا 1.6% w/w آملین، 0.035 تا 1.1% w/w آملید بود. و 0.037 تا 1.2% w/w اسید سیانوریک به ترتیب.

نتیجه

یک روش HPLC قوی، سریع و حساس برای تعیین ملامین و مواد مرتبط با آن در کودها توسعه یافته است. نتایج نشان می‌دهد که سنجش پیشنهادی می‌تواند محدودیت موقت ملامین 0.4% w/w صادر شده توسط اداره ایمنی مواد غذایی و امور مصرف‌کنندگان، وزارت کشاورزی (ژاپن)، جنگل‌داری و شیلات برای کلسیم سیانامید و کودهایی که حاوی کلسیم سیانامید هستند را برآورده کند.