آنالیز ویتامین های محلول در آب و چربی توسط HPLC-DAD

مقدمه

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) روش معمول معمولی است که در آنالیز ویتامین ها استفاده می شود. ویتامین ها ترکیبات متنوعی در ساختار، فعالیت های بیولوژیکی و خواص شیمیایی هستند و برای عملکرد طبیعی متابولیسم ضروری هستند. آنها به طور طبیعی در بسیاری از غذاها یافت می شوند، اما اغلب به محصولات غذایی فرآوری شده و داروها نیز اضافه می شوند. علاوه بر این، مکمل های ویتامین در بین افرادی که رژیم غذایی آنها محدود است روند رو به رشدی دارد. ویتامین ها به دو گروه تقسیم می شوند. محلول در آب و محلول در چربی. رایج ترین مکمل های ویتامین محلول در آب تیامین B₁ ، پیریدوکسین(B₆ )، سیانوکوبالامین B_12، ریبوفلاوین (B₂)،نیاسین (B₃)،نیکوتین آمید، گلوکوزید اسکوربیک، ویتامین C و اسید اریتوربیک. رایج ترین ویتامین های محلول در چربی عبارتند از رتینول (ویتامین A)، رتینول استات (ویتامین A استات)، ارگوکلسیفرول (D2).کوله کلسیفرول (D₃) ,dl-α-توکوفرول (ویتامین E)، dl-α-توکوفرول استات (ویتامین E استات) و فیلوکینون (K₁).

آنالیز معمول ویتامین ها به دلیل ماهیت ناپایدار آنالیت های هدف می تواند چالش برانگیز باشد. عوامل زیادی می توانند بر پایداری ویتامین تأثیر بگذارند مانند قرار گرفتن در معرض گرما، نور و هوا و همچنین برهمکنش با سایر اجزای غذا. با استفاده از کروماتوگرافی مایع فشار بالا فاز معکوس (HPLC) با تشخیص آرایه دیودی (DAD)، دو روش کیفی برای تشخیص ویتامین های محلول در آب و محلول در چربی به راحتی توسعه یافت. برای آنالیز کمی، روش‌های HPLC منفرد به دلیل ناپایداری ویتامین‌های مختلف توصیه می‌شود، که در آن تجزیه به طور منظم در طول آماده‌سازی نمونه رخ می‌دهد.

این مقاله آنالیز هر دو ویتامین محلول در آب و چربی توسط HPLC-DAD را شرح می دهد.

آزمایش

یک HPLC AGILENT با DAD با یک ستون فاز معکوس C18 پنج میکرومتری نصب شد و برای شناسایی همزمان 9 ترکیب محلول در آب مورد استفاده قرار گرفت. استانداردهای تحلیلی با محدوده 0.1mg/L تا 50mg/L در تترابوتیلامونیوم تهیه شد. برای تجزیه و تحلیل ویتامین B₁و ویتامین B₆، نمک هیدروکلراید استفاده شد. یکی از نمونه های مورد آنالیز، نمونه مکمل غذایی بود. نمونه ها قبل از اینکه از طریق فیلتر 0.45 میکرومتر فیلتر شوند 1:10 رقیق شدند. شرایط تحلیلی برای آنالیز هر دو ویتامین محلول در آب و چربی را می توان در جدول 1 یافت.

برای آنالیز ویتامین های محلول در چربی، همان  HPLC-DAD AGILENT برای آنالیز همزمان هفت آنالیت هدف استفاده شد. با استفاده از قابلیت DAD برای انتخاب چندین طول موج، شناسایی هر هفت آنالیت هدف در سه طول موج مختلف امکان پذیر شد. استفاده از طول موج های مختلف حیاتی است، زیرا ویتامین های محلول در چربی اغلب در غلظت های مختلف (ویتامین های هدف اصلی و سطوح کمیاب سایر ویتامین ها) وجود دارند.

استانداردهای تحلیلی با دامنه ای از 0.01mg/L تا 10mg/L برای ویتامین A، 0.1mg/L تا 100mg/L برای ویتامین A استات، ویتامین D2 تهیه شد. ویتامین D3 و ویتامین K₁. محدوده کالیبراسیون ویتامین E و ویتامین E استات 1mg/L تا 1000mg/L بود. از متانول به عنوان حلال رقت استفاده شد. یکی از نمونه ها شامل یک نمونه قطره چشمی غنی شده با ویتامین بود. همه نمونه ها با رقت 1:10 متانول قبل از عبور از فیلتر 0.2 میکرومتر آماده شدند.

نتایج

برای اطمینان از خطی بودن خوب، ویتامین C، اسید اریتوربیک و ویتامین B₁₂ به دلیل بی ثباتی ویتامین های موجود در شوینده باید روزانه تهیه شود. خطی بودن ویتامین های فوق 0.996 یا بیشتر بود. شکل 1 خطی بودن ویتامین B6 را نشان می دهدکه نماینده ترکیبات هدف باقیمانده است که همگی دارای مقدار خطی 1 بودند.

     شکل 2 کروماتوگرام استاندارد تحلیلی محلول در آب 5mg/L را نشان می دهد.

همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، تمام ویتامین ها شکل قله مجزا را نشان می دهند و به خوبی از هم جدا می شوند.

  شکل 3 کروماتوگرام نمونه مکمل غذایی را نشان می دهد.

نمونه مکمل غذایی حاوی چهار ویتامین ضروری محلول در آب بود. ویتامین B₁نیکوتین آمید، ویتامین C و ویتامین B₂. با استفاده از نرم افزار Compass CDS، شناسایی ترکیبات هدف از طریق مقایسه طیف جذب تایید می شود. طیف جذبی آنالیت نمونه با طیف جذبی همان ترکیب در استاندارد تحلیلی مقایسه می‌شود و سطح اطمینان بیشتری در نتایج به دست می‌دهد.

ویتامین های محلول در چربی خطی بسیار خوبی را برای هر هفت ترکیب هدف نشان دادند، با R²مقدار 0.9999 یا بیشتر. همانطور که خطی بودن عالی نشان داده می شود، محدوده غلظت گسترده را می توان بر روی SCION HPLC-Dad بدون نیاز به آماده سازی نمونه دشوار یا تنظیمات روش، حتی با ترکیبات هدف ناپایدار، آنالیز کرد.

شکل 4 کروماتوگرام استاندارد تحلیلی را با سه طول موج مختلاف استفاده شده نشان می دهد.

شکل 5 کروماتوگرام نمونه قطره چشمی دارویی غنی شده با ویتامین را با طیف مقایسه جذب ویتامین A (استاندارد و نمونه) نشان می دهد.

همانند ویتامین‌های محلول در آب،  Openlab برای مقایسه آنالیت‌های نمونه شناسایی شده و اجزای استاندارد تحلیلی، از طریق مقایسه‌های طیف جذبی استفاده شد. دو جزء شناسایی شده در نمونه قطره چشم ویتامین A و ویتامین E استات بود.

نتیجه

دو تجزیه و تحلیل مختلف برای شناسایی همزمان 9 ویتامین محلول در آب و هفت ویتامین محلول در چربی به راحتی با استفاده از AGILENT HPLC با دتکتور DAD به دست آمد. آماده سازی نمونه یک عامل کلیدی است که باید در طول این کاربردها به دلیل خواص ناپایدار ویتامین ها در نظر گرفته شود. به خصوص ویتامین C و اسید اریتوربیک. استفاده از قابلیت طول موج چندگانه دتکتور DAD امکان شناسایی همزمان ویتامین های محلول در چربی، با محدوده غلظت های مختلف، در سه طول موج مختلف را فراهم می کند. این امر نیاز به آماده سازی نمونه گسترده یا روش های تحلیلی متعدد را از بین برد. نرم افزار Openlab امکان مقایسه آسان طیف جذبی را برای تایید در شناسایی فراهم می کند

جهت مشاوره و خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی با مشاوران واحد فروش شرکت شناسا پرتوژن ۷۵۳۱۱ – ۰۲۱ در ارتباط باشید.