آنالیز سموم مایکوتوکسین ها با دستگاه HPLC
آفلاتوکسین‌ها شناخته‌شده‌ترین گروه مایکوتوکسین‌ها هستند که به‌عنوان متابولیت‌های ثانویه توسط قارچ‌ها، عمدتاً توسط Aspergillus parasiticus و Aspergillus flavus، و همچنین به میزان کمتری توسط سویه‌های دیگر تولید می‌شوند. این منشاء همچنین جایی است که نام سم آسپرژیلوس فلاووس از آن گرفته شده است.
تولید آفلاتوکسین بر روی محصولات کشاورزی در مزرعه و یا در زمان نگهداری محصولات کشاورزی به ویژه در شرایط رطوبت بالا و گرم امکان پذیر است. این مواد متأسفانه می توانند برای مدت طولانی حتی پس از کشته شدن قارچ ها باقی بمانند و در نتیجه غذاها را آلوده کنند.
بیشتر مایکوتوکسین ها ترکیبات پایداری هستند که در طی پخت و پز یا فرآوری غذا از بین نمی روند. با وجود مقادیر زیاد آفلاتوکسین، تنها تعداد محدودی در عمل (تحلیلی) قابل توجه است.
آفلاتوکسین B1 بسیار گسترده است و در محصولات غذایی و خوراکی مانند پنبه دانه، ذرت و بادام زمینی وجود دارد. این ماده بسیار سمی است و توسط سازمان جهانی بهداشت به عنوان سرطان‌زای گروه 1 طبقه‌بندی شده است. آفلاتوکسین های B2، G1، و G2 معمولاً همراه B غلظت های کمتر در نمونه های آلوده یافت می شوند.ترتیب سمیت AFB1 > AFG1 > AFB2 > AFG2 است.
اکراتوکسین A ) OTA ) یک مایکوتوکسین است که از گونه های مختلف آسپرژیلوس و پنی سیلیوم تشکیل شده است. OTA می تواند در طول رشد گیاه تولید شود، اما اغلب در طی تبدیل و ذخیره سازی مواد غذایی ایجاد می شود.دئوکسی نیوالنول (DON) یکی از انواع مایکوتوکسین است که توسط گونه‌های خاص فوزاریوم ایجاد می‌شود که اغلب برنج، جو، جو، گندم، ذرت و غلات مختلف را در حین نگهداری یا در مزرعه آلوده می‌کند.
انسان در معرض خطر قرار گرفتن به طور غیر مستقیم از طریق مواد غذایی با منشاء حیوانی (تخم مرغ، شیر، جگر، کلیه) یا مستقیماً از طریق غذاهای با منشاء گیاهی (غلات) است. این ماده در تریتیکاله، سورگوم، گندم سیاه و سایر محصولات غذایی مانند آبجو، مالت، پنکیک، ذرت بو داده، غذاهای مخصوص نوزادان، رشته فرنگی، غلات صبحانه، نان و آرد یافت شده است.
DON بر سلامت انسان و حیوان تأثیر می گذارد و باعث سرگیجه، سردرد، درد شکم، اسهال، استفراغ، حالت تهوع موقت حاد و تب می شود.Zearalenone (ZON) یک مایکوتوکسین است که متعلق به جنس Fusarium است و عمدتاً در غذا و خوراک تولید می شود. توسعه روش‌های تحلیلی مؤثر برای شناسایی و تعیین کمیت بسیار مهم است، زیرا مایکوتوکسین‌ها می‌توانند به راحتی وارد بازار شوند و سلامت عمومی را به خطر بیندازند. این روش ها در مقیاس وسیع توسط موسسات دولتی و سازمان های حفاظت از سلامت برای نظارت بر خوراک دام تجاری و محصولات غذایی استفاده می شود. در صنعت فرآوری خوب از همین روش ها برای بررسی مواد خام و محصولات استفاده می شود تا آنها را به کشورهای دارای قوانین مناسب هدایت کنند.
شکل 1.ساختار شیمیایی آفلاتوکسین های تعیین شده
کشورهای سراسر جهان وجود آفلاتوکسین B را در طیف گسترده ای از غذاهای فرآوری نشده و فرآوری شده کنترل می کنندB1،B2،G2،G1نمودار 1 به طور مثال محدودیت‌های عملی تعیین شده توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده را نشان می‌دهد (سطوحی که FDA اقدامات قانونی را برای حذف محصولات از بازار انجام می‌دهد). نمودارهای 2 تا 5 محدودیت‌های ZON، OTA، DON و حداکثر سطوح آفلاتوکسین را نشان می‌دهند که توسط کمیسیون اروپا مطابق با مقررات EG 1881/2006 تعیین شده است.
نمودار 1.سطوح عمل FDA برای آفلاتوکسین در مواد غذایی انسان، خوراک دام و مواد تشکیل دهنده خوراک دام
| استفاده در نظر گرفته شده | غلات، محصولات جانبی غلات، خوراک یا سایر محصولات | سطح آفلاتوکسین [µg/kg] |
| مصرف انسان | شیر | 0.5 |
| مصرف انسان | مواد غذایی، بادام زمینی و محصولات بادام زمینی، آجیل برزیل و پسته | 20 |
| حیوانات نابالغ | ذرت، فرآورده های بادام زمینی و سایر خوراک ها و مواد تشکیل دهنده حیوانات، به استثنای کنجاله پنبه دانه | 20 |
| حیوانات شیری، حیواناتی که در بالا ذکر نشده اند یا موارد استفاده ناشناخته | ذرت، محصولات بادام زمینی، پنبه دانه، و سایر خوراک و مواد تشکیل دهنده حیوانات | 20 |
| پرورش گاو، پرورش خوک و طیور بالغ | محصولات ذرت و بادام زمینی | 100 |
| فینیشینگ خوکی با وزن 100 پوند یا بیشتر | محصولات ذرت و بادام زمینی | 200 |
| تکمیل (یعنی پرواری) گاو گوشتی | محصولات ذرت و بادام زمینی | 300 |
| گوشت گاو، گاو، خوک یا طیور، صرف نظر از سن یا وضعیت پرورش | کنجاله پنبه دانه | 300 |
نمودار 2.حداکثر سطوح DON در مواد غذایی توسط کمیسیون اروپا تعیین شده است
| مواد غذایی | حداکثر سطح [µg/kg] |
| غلات فرآوری نشده به غیر از گندم دوروم، جو و ذرت | 1250 |
| گندم دوروم و جو دوسر فرآوری نشده | 1750 |
| ذرت فرآوری نشده | 1750 |
| غلات در نظر گرفته شده برای مصرف مستقیم انسان، آرد غلات (شامل آرد ذرت، پودر ذرت و بلغور ذرت، سبوس به عنوان محصول نهایی به بازار عرضه شده برای مصرف مستقیم انسان و جوانه | 750 |
| پاستا (خشک) | 750 |
| نان (شامل اجناس کوچک نانوایی)، شیرینی، بیسکویت، تنقلات غلات و غلات صبحانه | 500 |
| غذاهای فرآوری شده بر پایه غلات و غذاهای کودک برای نوزادان و کودکان خردسال | 200 |
نمودار 3.حداکثر سطوح برای آلاینده های خاص در مواد غذایی توسط کمیسیون اروپا تعیین شده است
| مواد غذایی | حداکثر سطح آفلاتوکسین [µg/kg] | |
| B1 | مجموع B1، B2، G1، G2 | |
| بادام زمینی باید قبل از مصرف انسان یا استفاده به عنوان یک عنصر در مواد غذایی تحت دسته بندی یا سایر درمان های فیزیکی قرار گیرد. | 8.0 | 15.0 |
| آجیل ها باید قبل از مصرف انسان یا استفاده به عنوان یک ماده در مواد غذایی تحت دسته بندی یا سایر درمان های فیزیکی قرار گیرند. | 5.0 | 10.0 |
| بادام زمینی و آجیل و فرآورده های فرآوری شده آنها، برای مصرف مستقیم انسان یا استفاده به عنوان یک عنصر در مواد غذایی | 2.0 | 4.0 |
| میوه‌های خشک قبل از مصرف انسانی یا استفاده به‌عنوان یک ماده در مواد غذایی تحت دسته‌بندی یا سایر درمان‌های فیزیکی قرار گیرند. | 5.0 | 10.0 |
| میوه های خشک و فرآورده های فرآوری شده آن، برای مصرف مستقیم انسان یا استفاده به عنوان یک عنصر در مواد غذایی | 2.0 | 4.0 |
| تمام غلات و تمام محصولات مشتق شده از غلات، از جمله محصولات فرآوری شده غلات | 2.0 | 4.0 |
| ذرت باید قبل از مصرف انسان یا استفاده به عنوان یک عنصر در مواد غذایی تحت دسته بندی یا سایر درمان های فیزیکی قرار گیرد. | 5.0 | 10.0 |
| شیر خام، شیر عملیات حرارتی شده و شیر برای تولید محصولات مبتنی بر شیر | – | – |
| گونه های زیر از ادویه ها: Capsicum spp. (میوه های خشک آن، کامل یا آسیاب شده، از جمله فلفل، پودر فلفل قرمز، کاین و پاپریکا) Piper spp. (میوه های آن از جمله فلفل سفید و سیاه)، Myristica fragrans (جوز هندی)، Zingiber officinale (زنجبیل)، Curcuma longa (زردچوبه) | 5.0 | 10.0 |
| غذاهای فرآوری شده بر پایه غلات و غذاهای کودک برای نوزادان و کودکان خردسال | 0.10 | – |
| شیر خشک و شیر خشک برای نوزادان، از جمله شیر نوزاد و شیر بعدی | – | – |
| غذاهای رژیمی برای اهداف پزشکی خاص که به طور خاص برای نوزادان در نظر گرفته شده است | 0.10 | – |
نمودار 4.حداکثر سطوح OTA در مواد غذایی توسط کمیسیون اروپا تعیین شده است
| مواد غذایی | حداکثر سطح [µg/kg] |
| غلات فرآوری نشده | 5.0 |
| تمام محصولات مشتق شده از غلات فرآوری نشده، از جمله محصولات غلات فرآوری شده و غلاتی که برای مصرف مستقیم انسان در نظر گرفته شده است. | 3.0 |
| میوه خشک تاک (مویز، کشمش و سلطانیه) | 10.0 |
| دانه های قهوه برشته شده و قهوه بو داده آسیاب شده، به استثنای قهوه محلول | 5.0 |
| قهوه محلول (قهوه فوری) | 10.0 |
| شراب (شامل شراب گازدار، به استثنای شراب لیکور و شراب با قدرت الکلی حداقل 15 درصد حجم) و شراب میوه ای | 2.0 |
| شراب معطر، نوشیدنی های مبتنی بر شراب معطر و کوکتل های محصول شراب معطر | 2.0 |
| شیره انگور، آب انگور غلیظ به صورت بازسازی شده، شهد انگور، شیره انگور و شیره انگور غلیظ به صورت آماده، برای مصرف مستقیم انسان | 2.0 |
| غذاهای فرآوری شده بر پایه غلات و غذاهای کودک برای نوزادان و کودکان خردسال | 0.50 |
| غذاهای رژیمی برای اهداف پزشکی خاص که به طور خاص برای نوزادان در نظر گرفته شده است | 0.50 |
| قهوه سبز، میوه های خشک به غیر از میوه های تاک خشک، آبجو، کاکائو و محصولات کاکائو، شراب های لیکور، محصولات گوشتی، ادویه ها و شیرین بیان | – |
نمودار 5.حداکثر سطوح برای ZON در مواد غذایی توسط کمیسیون اروپا تعیین شده است
| مواد غذایی | حداکثر سطح [µg/kg] |
| غلات فرآوری نشده به جز ذرت | 100 |
| ذرت فرآوری نشده | 200 |
| غلات در نظر گرفته شده برای مصرف مستقیم انسان، آرد غلات، سبوس به عنوان محصول نهایی به بازار عرضه شده برای مصرف مستقیم انسان و جوانه | 75 |
| ذرت در نظر گرفته شده برای مصرف مستقیم انسان، آرد ذرت، پودر ذرت، بلغور ذرت، جوانه ذرت و روغن ذرت تصفیه شده | 200 |
| نان (شامل اجناس کوچک نانوایی)، شیرینی، بیسکویت، تنقلات غلات و غلات صبحانه، به استثنای تنقلات ذرت و غلات صبحانه مبتنی بر ذرت | 50 |
| تنقلات ذرت و غلات صبحانه مبتنی بر ذرت | 50 |
| غذاهای فرآوری شده با غلات (به استثنای غذاهای فرآوری شده با ذرت) و غذاهای کودک برای نوزادان و کودکان خردسال | 20 |
| غذاهای فرآوری شده بر پایه ذرت برای نوزادان و کودکان خردسال | 20 |
نظری: آماده سازی نمونه توصیه شده
علاوه بر روش نمونه برداری و آسیاب، روش سنتی برای آنالیز آفلاتوکسین شامل مرحله استخراج، پاکسازی نمونه با استفاده از استخراج فاز جامد (SPE) از طریق کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) است. با این حال، این تکنیک به دلیل زمان‌بر بودن مراحل استخراج و پاکسازی، ظرفیت نمونه را محدود می‌کند. شکل 2 مروری بر مراحل کلی به کار رفته در آنالیز آفلاتوکسین ارائه می دهد.
برای مشاهده انواع دستگاه HPLC برای آنالیز سموم می توانید بر روی اینجا کلیک فرمائید
شکل 2.روش تجزیه و تحلیل عمومی برای تعیین آفلاتوکسین
پارامترهای روش
آفلاتوکسین B1,G1 تشخیص آنها دشوار است زیرا آنها فقط حداقل فلورسانس را نشان می دهند. تابش مخلوط آفلاتوکسین با نور UV 254 نانومتر، آفلاتوکسین B1 و G1 هیدروکسیلاسیون ناشی از عکس را طی می کنند و سپس از طریق طیف سنجی فلورسانس با حساسیت بیشتری اندازه گیری می شوند.
| ستون | Eurospher II 100-3 C18، شناسه 250 × 4 میلی متر با پیش ستون | ||
| شوینده A | اب | ||
| شوینده B | استونیتریل | ||
| شیب | زمان [دقیقه] | ٪ A | % B |
| 0.00 | 60 | 40 | |
| 6.00 | 60 | 40 | |
| 6.50 | 20 | 80 | |
| ساعت 10.00 | 10 | 90 | |
| ساعت 11.00 | 10 | 90 | |
| نرخ جریان | 1.5 میلی لیتر در دقیقه | ||
| حجم تزریق | 5 میکرولیتر | ||
| دمای ستون | 40 درجه سانتی گراد | ||
| تشخیص UV | 220 نانومتر (20 هرتز) | ||
| تشخیص FLD | Ex 329 نانومتر Em 460 نانومتر (5 هرتز، 0.1 ثانیه، حساسیت: زیاد، بهره 16) پس از مشتق سازی ستون با راکتور فتوشیمیایی UVE در 100 میکروآمپر | ||
نتایج
کروماتوگرام FLD پس از مشتق سازی ستون از راکتور UVE در شکل 3 نشان داده شده است. شکل 4 کروماتوگرام DAD را برای همان اجرا که در آن DON شناسایی شده است نشان می دهد. جداسازی روی ستون Eurospher II 100-3 C18 به خوبی کار می کند. قله ها از هم جدا شده اند و همچنین شکل خوبی از خود نشان می دهند.
شکل 3.1 کروماتوگرام FLD برای آنالیز مایکوتوکسین با استفاده از راکتور فتوشیمیایی UVE برای مشتق سازی پس از ستون
شکل 4.کروماتوگرام DAD در 220 نانومتر برای آنالیز مایکوتوکسین با استفاده از راکتور فتوشیمیایی UVE برای مشتق‌سازی پس از ستون
نتیجه
DON، ZON و 4 آفلاتوکسین B1،B2,G1,G2 یک مرحله کروماتوگرافی با استفاده از راکتور فتوشیمیایی UVE برای مشتق‌سازی پس از ستون همراه با ستون Eurospher II C18 و سیستم HPLC تحلیلی آزورا توضیح بیشتر در مورد تعیین OTA ضروری است.
تجزیه و تحلیل مواد دیگر تحت تأثیر قرار نمی‌گیرد، زیرا فاز متحرک برای این روش مشتق‌سازی ستونی تغییر نمی‌کند. راکتور فتوشیمیایی به راحتی اداره می شد زیرا مواد شیمیایی اضافی برای مشتق سازی مورد نیاز نبود. این نرم افزار یک جایگزین ساده برای تعیین مایکوتوکسین ها ارائه می دهد.
ویژگی های فیزیکی ستون پیشنهادی
| فاز ثابت | Eurospher II 100-3 C18 |
| کد USP | L 1 |
| اندازه منفذ | 100 Å |
| حجم منافذ | 0.8 میلی لیتر در گرم |
| سطح خاص | 20 ± 320 متر2/g |
| اندازه ذرات | 3 میکرومتر |
| فرم | کروی |
| % C | 16 |
| پایان بندی | آره |
| ابعاد | شناسه 250 × 4 میلی متر با پیش ستون |
| شماره سفارش | 25WE181E2G |
اولین دیدگاه را ثبت کنید