سرب (Pb) و کادمیوم (Cd) آلاینده های بسیار سمی هستند که در غلات یافت می شوند. سرب حتی در سطوح کمی برای اندام های انسان مضر است و هنگامی که در بدن جمع می شود، مانع تشکیل هموگلوبین می شود و می تواند منجر به اختلالات عصبی شود.¹

Cd حتی به عنوان سرطان‌زا برای انسان طبقه‌بندی می‌شود [گروه 1 – طبق آژانس بین‌المللی تحقیقات سرطان].²

بر اساس گزارش ها، کادمیوم باعث مشکلات شدید کلیوی می شود که می تواند کشنده باشد.³و همچنین منجر به مشکلات کبدی و استخوان های شکننده می شود.

برنج به عنوان پرمصرف ترین غلات در آسیا/چین، می تواند به سرعت سرب و کادمیوم را از سموم، آفت کش ها و کودهای موجود در خاک جذب کند و در نتیجه سلامت میلیون ها نفر را از طریق رژیم غذایی خود به خطر بیندازد. بنابراین، توسعه یک روش ساده و قابل اعتماد برای کنترل سطوح سرب و کادمیوم در برنج از اهمیت بالایی برخوردار است.

طبق استاندارد ملی چین GB 2715-2016 Hygienic Standard for Grain، حداکثر غلظت سرب یا کادمیوم مجاز در دانه ها باید کمتر از 0.2 میلی گرم بر کیلوگرم باشد. سطح مجاز در اتحادیه اروپا همان است [EC 1881/2006].

تکنیک رسمی برای شناسایی فلزات سنگین در هر دو مورد از طیف‌سنجی جذب اتمی کوره گرافیت می باشد. (GFAAS, GB/T 5009. 12-2017, GB/T 5009-2017. 15 و EN 14083:2003).

نمونه‌ها را می‌توان از طریق روش‌های مختلف، از جمله هضم مایکروویو، هضم بلوک داغ، خاکستر خشک و هضم صفحه داغ، آماده کرد. که این روش های هضم سنتی کشف شده پیچیده و زمان بر هستند (دو تا چهار ساعت یا حتی بیشتر).

علاوه بر این، روش‌های سنتی آماده‌سازی نمونه، به مقادیر زیادی از معرف‌های خورنده و اکسیدکننده نیاز دارند، که احتمال آلودگی را تشدید می‌کند که می‌تواند نتایج نادرست ایجاد کند.

برای هضم مایکروویو، ظروف PTFE ویژه مورد نیاز است، با این حال، ظروف قابل استفاده مجدد نیز ممکن است منجر به آلودگی متقاطع شوند. روش پیش تصفیه مورد استفاده در این آزمایش “هضم سریع” است، که نسخه تقویت شده هضم بلوک داغ است.

برخلاف هضم های فوق، هضم سریع فرآیند پیش تصفیه را تنها با استفاده از لوله های پلی پروپیلن و اسید نیتریک ساده می کند (جدول 1). در طول این مطالعه، یک روش سریع و دقیق برای آنالیز سطح ردیابی سرب و کادمیوم در دانه‌های برنج با استفاده از هضم سریع با دستگاه جذب اتمی کوره.

 

جدول 1.تکنیک های مختلف هضم نمونه؛ حجم معرف بر اساس نمونه 0.2 – 0.5 گرم.

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

روش هضم	معرف	زمان (ساعت)	کشت
مایکروویو	5 میلی لیتر HNO32 میلی لیتر H2O2	1-2	ظرف PTFE و فلاسک حجمی قابل استفاده مجدد
خیس	10 میلی لیتر HNO30.5 میلی لیتر HClO4	4-5	لیوان های قابل استفاده مجدد و فلاسک حجمی
سریع	1.5 میلی لیتر HNO3	0.5	لوله های حجمی یکبار مصرف

 

 

شرایط آزمایشی

ابزار دقیق

اندازه‌گیری‌ها با استفاده از طیف‌سنج جذب اتمی کوره PerkinElmer PinAAcle 900T (AA) (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, USA)، مجهز به نرم‌افزار بصری Syngistix™ AA برای آنالیز نمونه داده‌های ساده و آرشیو نتایج است استفاده شد.

PinAAcle 900T مجهز به دوربین کوره TubeView™ است که برای هماهنگ کردن نوک خودکار نمونه‌بردار در لوله گرافیتی و مشاهده تجمع باقیمانده در طول آنالیز نمونه ساخته شده است. PinAAcle 900T همچنین مجهز به کوره زیمن طولی پیشرفته برای تصحیح پس زمینه است.

طراحی جدید اتمایزر گرافیت گرم شده عرضی (THGA) توزیع دما یکنواخت را در کل طول تیوب گرافیتی ارائه می دهد. این برخلاف گرمایش تیوب است که در آن فقط مناطق خاصی در تیوب گرمایش یکنواخت را تجربه می کنند.

THGA همچنین فرآیند گرمایش سریعتر را در تیوب گرافیتی تسهیل می کند. علاوه بر این، THGA توانایی حذف اثرات مموری و تداخلات بالقوه ای را که ممکن است با آنالیز نمونه های ماتریس بالا رخ دهد، نشان داده است که منجر به نتایج بسیار دقیق می شود.

 

جهت مشاهده فروشگاه دستگاه جذب اتمی کوره لطفا کلیک فرمایید.

 

آماده سازی نمونه

برای آنالیز دقیق برنج، هضم مایکروویو، هضم فشار، و هضم مرطوب معمولا از روش های آماده سازی نمونه استفاده می شود.

جدول 1 معرف ها، مقادیر، زمان و نوع ظرف مورد استفاده در این تکنیک های آماده سازی نمونه و همچنین در هضم سریع را نشان می دهد. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، تنها 1.5 میلی لیتر اسید نیتریک برای هضم سریع ضروری است. پیش تصفیه در ویال های پلاستیکی یکبار مصرف انجام می شود که در واقع آلودگی احتمالی را نیز به حداقل می رساند.

استفاده از حجم معرف کمتر هضم سریع و کاهش هزینه را در مقایسه با تکنیک های سنتی تسهیل می کند. آماده سازی نمونه را می توان در عرض 0.5 ساعت با روش هضم سریع انجام داد.

در یک چرخه هضم سریع اولیه، حدود 0.5 گرم از هر نمونه دقیقاً در مقادیر تکراری وزن شد و برای هضم سریع به لوله‌های نمونه‌بر خودکار پلی پروپیلن 50 میلی‌لیتری منتقل شد.

به دنبال این مراحل، 1.5 میلی لیتر اسید نیتریک غلیظ اضافه شد و ویال با درپوش آزاد متعاقباً در سیستم هضم بلوک آماده سازی نمونه (سری SPB، PerkinElmer) به مدت 30 دقیقه در دمای 120 درجه سانتی گراد حرارت داده شد. نمونه های هضم شده از طریق رقیق سازی با آب DI به 25 میلی لیتر رساندند.

سه نمونه (نمونه های A، B و C) از آزمون های مهارت در منطقه شانگهای در این آزمایش مشاهده شد.

 

جدول 2.شرایط ابزاری برای آنالیز سرب و کادمیوم در دانه های برنج در طیف سنج PinAAcle 900T

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

پارامتر	سرب (Pb)	کادمیوم (Cd)
طول موج (nm)	283.31	228.80
عرض شکاف (nm)	0.7	0.7
نوع لامپ*	EDL	EDL
نوع اندازه گیری	منطقه قله	منطقه قله
زمان خواندن (ثانیه)	4	4
حجم نمونه (μL)	16	16
حجم رقیق کننده (μL)	16	16
اصلاح کننده ماتریس	0.05٪ Pd	0.05٪ Pd
حجم اصلاح کننده ماتریس (μL)	5	5
معادله کالیبراسیون	اضافه استاندارد	اضافه استاندارد
غلظت استاندارد (μg/L)	0، 12.5، 25، 37.5	0، 1.25، 2.5، 3.75

* EDL برای محدودیت های تشخیص بهتر و حساسیت استفاده شد.

 

ماده مرجع گواهی شده (CRM) NIST 1568 نیز برای واجد شرایط بودن روش های هضم و آنالیز ارزیابی شد. هر نمونه در معرض سه تکرار قرار گرفت: دو تکرار با هضم سریع و یکی با هضم مرطوب معمولی. تعیین سرب و کادمیوم در CRM با هضم سریع سه بار تکرار شد.

شرایط تحلیلی جذب اتمی کوره در کل فرآیند ثابت بود. شرایط ابزاری در جدول 2 ارائه شده است و برنامه های دمایی کوره گرافیت بهینه شده در جداول 3 و 4 به تفصیل آمده است.

جدول 3.برنامه های دمایی بهینه برای آنالیز سرب در دانه های برنج در طیف سنج جذب اتمی کوره PinAAcle 900T.

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

سرب (Pb)
دما (درجه سانتیگراد)	رمپ (های)	دارای)	جریان گاز داخلی (میلی لیتر در دقیقه)	نوع گاز
120	5	30	250	طبیعی
150	30	30	250	طبیعی
700	10	20	250	طبیعی
1800		4		طبیعی
2500	1	5	250	طبیعی

 

جدول 4.برنامه های دمایی بهینه برای آنالیز Cd در دانه های برنج در طیف سنج PinAAcle 900T.

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

کادمیوم (Cd)
دما (درجه سانتیگراد)	رمپ (های)	دارای)	جریان گاز داخلی (میلی لیتر در دقیقه)	نوع گاز
120	5	30	250	طبیعی
150	30	30	250	طبیعی
500	10	20	250	طبیعی
1500		4		طبیعی
2500	1	5	250	طبیعی

 

نتایج و بحث

منحنی های اصلی کالیبراسیون جمع سرب و کادمیوم در شکل 1 نشان داده شده است که R را نشان می دهد.²مقدار ≥ 0.999، خطی بودن تحلیل را نشان می دهد. تمام پیک های نمونه و استانداردهای کالیبراسیون را می توان در شکل 2 مشاهده کرد.

همان زمان ظهور پیک و شکل پیک نشان می‌دهد که اثرات ماتریس با استفاده از روش اضافه استاندارد با موفقیت حذف شدند.

شکل 1.منحنی اضافه استاندارد سرب (چپ) و کادمیوم (راست) در برنج. اعتبار تصویر: ایمنی و کیفیت مواد غذایی PerkinElmer

شکل 2.پوشش سیگنال های سرب (چپ) و کادمیوم (راست) در سه نمونه و NIST 1568 و تکرارهای آنها. اعتبار تصویر: ایمنی و کیفیت مواد غذایی PerkinElmer

 

جدول 5.MDL ها با استفاده از طیف سنج PinAAcle 900T.

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

آنالیت	MDL (3σ، μg/kg)
	محاسبه شد	تنظیم شده است
سرب	5.4	20a	20c
کادمیوم	0.8	1.0b	20c

(0.5 grams sample diluted to 25 mL; ^a: regulated in GB 5009.12-2017; ^b: regulated in GB 5009.15-2014; ^c: regulated in (EC) No 1881/2006)

 

جدول 6.آنالیز NIST 1568 که توسط هضم سریع روی طیف‌سنج PinAAcle 900T hLHNI شده است.

منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

آنالیت	ارزش تایید شده (میلی گرم بر کیلوگرم)	مقدار اندازه گیری شده (mg/kg)
سرب	NA	NA
کادمیوم	0.004 ± 0.029	0.028

 

حدود تشخیص روش (MDLs) محاسبه شد (جدول 5) و بر انحراف استاندارد 11 تکرار از ماده خالی معرف با ضریب رقت مورد استفاده در آماده سازی نمونه محاسبه شد. MDL ها از سطوح تنظیم شده کوتاهی می کنند و قابلیت های آن را به نمایش می گذارند سیستم PinAAcle 900T برای اندازه گیری غلظت های پایین در ماتریس های دشوار.

 

جدول 7.نتایج برای تشخیص سرب و کادمیوم در دانه برنج (mg/kg). منبع: PerkinElmer Food Safety and Quality

نمونه	سرب (mg/kg)				کادمیوم (mg/kg)
	FD1	FD2	WD	انحراف*٪	FD1	FD2	WD	انحراف*٪
آ	0.38	0.39	0.40	3.8	0.37	0.36	0.37	1.4
ب	0.82	0.81	0.81	0.6	0.71	0.71	0.71
سی	1.33	1.32	1.20	9.9	1.14	1.15	1.20	4.7

 Deviation (%) = ×100% , where N₁: average of FD1 and FD2; N₂: WD; N_avg: average of N₁ and N₂

 

 

قابلیت اطمینان و دقت روش با ارزیابی NIST 1568 تعیین شد. اگرچه سرب در NIST 1568 تایید نشده بود، مقدار اندازه گیری شده Cd در CRM 0.028 میکروگرم در لیتر است که با محدودیت ارائه شده توسط NIST مطابق با جزئیات است. جدول 6. نتایج حاصل از ارزیابی سه نمونه در جدول 7 آورده شده است.

برای هضم سریع (FD)، نمونه ها دو بار هضم و برای ارزیابی تکرارپذیری آنالیز شدند. نمونه ها همچنین با هضم مرطوب (WD) اندازه گیری شدند، به طوری که نتایج هضم سریع می تواند در مقابل یک روش آماده سازی نمونه سنتی متضاد باشد.

برای هر یک از سه نمونه و محدوده غلظت، نتایج هم راستا هستند، که نشان دهنده دقت و تکرارپذیری روش هضم سریع است.

دقت حاصل مطابق با الزامات موجود در GB 5009.12 و GB 5009.15 (انحراف ≤20%) و مطابق با (EC) 333/2007 است (مقادیر HorRatr یا HorRatR کمتر از 2 – محاسبه تفصیلی را می توان در مرجع 4 یافت).

نتیجه گیری

هضم سریع و سپس جذب اتمی کوره برای آنالیز سرب و کادمیوم در دانه های برنج استفاده شد. روش هضم سریع با استفاده آسان می تواند زمان آماده سازی نمونه را به طور موثر کاهش دهد و از هرگونه آلودگی احتمالی ناشی از استفاده اضافی از معرف و ظروف قابل استفاده مجدد جلوگیری کند.

هنگامی که در ارتباط با خودکار استفاده می شود PinAAcle 900T GFAAS برای کاهش تداخلات شیمیایی و ماتریسی، شناسایی دقیق سرب و کادمیوم در سطح ردیابی با موفقیت با روش استاندارد افزودن به دست آمد.

این نرم افزار پتانسیل آن را دارد که به آنالیز فلزات سنگین در طیف گسترده ای از انواع مواد غذایی دیگر، از جمله ذرت، غلات، آرد، لوبیا و شیرخشک بسط داده شود.

References

1. WHO: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs379/en/
2. IARC: http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/latest_classif.php
3. U.S. ATSDR: https://www.atsdr.cdc.gov/csem/csem.asp?csem=6&po=12
4. Horwitz W., Albert R., J. AOAC Int. 2006 Jul-Aug; 89(4):1095-109. ‘The Horwitz ratio (HorRat): A useful index of method performance with respect to precision’