1-مروری بر HPLC

HPLC مخفف عبارت High Performance Liquid Chromatography است. “کروماتوگرافی” تکنیکی برای جداسازی، “کروماتوگرام” حاصل کروماتوگرافی و “کروماتوگرافی” ابزاری است که برای انجام کروماتوگرافی استفاده می شود.

در میان فن‌آوری‌های مختلف توسعه‌یافته برای کروماتوگرافی، دستگاه‌های اختصاص داده شده برای جداسازی مولکولی به نام ستون‌ها و پمپ‌های با کارایی بالا برای تحویل حلال با سرعت جریان پایدار، برخی از اجزای کلیدی کروماتوگراف‌ها هستند. با پیچیده‌تر شدن فناوری‌های مرتبط، سیستمی که معمولاً به عنوان کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا شناخته می‌شود، به سادگی به عنوان «LC» شناخته می‌شود. امروزه، کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق العاده بالا (UHPLC) که قادر به تجزیه و تحلیل با سرعت بالا است، نیز گسترده تر شده است.

فقط ترکیبات محلول در حلال ها را می توان با HPLC آنالیز کرد. HPLC ترکیبات محلول در یک نمونه مایع را جدا می کند و امکان تجزیه و تحلیل کمی و کیفی را در مورد اینکه چه اجزایی و چه مقدار از هر جزء در نمونه وجود دارد را می دهد.

شکل 1 یک نمای کلی از فرآیند HPLC را نشان می دهد. حلال مورد استفاده برای جداسازی اجزای یک نمونه مایع برای تجزیه و تحلیل HPLC فاز متحرک نامیده می شود. فاز متحرک به یک ستون جداسازی، که در غیر این صورت به عنوان فاز ثابت شناخته می شود، و سپس به آشکارساز با سرعت جریان پایدار که توسط پمپ تحویل حلال کنترل می شود، تحویل داده می شود. مقدار مشخصی از نمونه به ستون تزریق می شود و ترکیبات موجود در نمونه جدا می شوند. ترکیبات جدا شده در ستون توسط یک آشکارساز پایین دست ستون شناسایی شده و هر ترکیب شناسایی و کمی سازی می شود.

 

عکس. 1-بررسی اجمالیHPLC

 

2-دستگاه HPLC

“نمای اجمالی اساسی فرآیند HPLC” (همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است) و مکانیسم های آن اکنون پوشش داده شده است. با پرداختن به جزئیات بیشتر، HPLC از اجزای مختلفی از جمله پمپ انتقال حلال، واحد گاززدایی، نمونه تشکیل شده است. انژکتور، کوره ستونی، آشکارساز و پردازشگر داده.شکل 2 نمودار جریان HPLC و نقش هر جزء را نشان می دهد.

شکل 2　نمودار جریان HPLC

همانطور که برای HPLC، پمپ فاز متحرک را با نرخ جریان کنترل شده (a) تحویل می دهد. هوا می تواند به راحتی در فاز متحرک تحت فشار اتمسفر استانداردی که در آن زندگی می کنیم حل شود. اگر فاز متحرک حاوی حباب های هوا باشد و وارد پمپ تحویل شود، ممکن است مشکلاتی مانند نوسانات سرعت جریان و نویز/ رانش خط پایه رخ دهد. واحد گاز زدایی با حذف حباب های هوا در فاز متحرک (b) به جلوگیری از این مشکل کمک می کند. پس از حذف هوای محلول، فاز متحرک به ستون تحویل داده می شود. سپس انژکتور نمونه یک محلول استاندارد یا محلول نمونه را وارد فاز متحرک (c) می کند. نوسانات دما می تواند بر جداسازی ترکیبات در ستون تاثیر بگذارد. ستون را در کوره ستونی قرار می دهند تا دما را ثابت نگه دارد(d). ترکیبات شسته شده از ستون توسط یک آشکارساز که در پایین دست ستون (e) قرار می گیرد، شناسایی می شوند. یک ایستگاه کاری سیگنال آشکارساز را برای به دست آوردن کروماتوگرام برای شناسایی و کمیت ترکیبات (f) پردازش می کند.

3-جداسازی HPLC

HPLC می تواند هر ترکیب را با تفاوت سرعت هر ترکیب در ستون جدا کرده و تشخیص دهد. شکل 3 نمونه ای از جداسازی HPLC را نشان می دهد.

برای HPLC دو فاز وجود دارد: فاز متحرک و فاز ثابت. فاز متحرک مایعی است که ترکیب مورد نظر را حل می کند. فاز ساکن بخشی از یک ستون است که با ترکیب هدف تعامل دارد.

در ستون، هرچه میل ترکیبی (مثلاً نیروی واندروالس) بین مولفه و فاز متحرک قوی‌تر باشد، جزء سریع‌تر همراه با فاز متحرک در ستون حرکت می‌کند. از سوی دیگر، هر چه میل ترکیبی با فاز ساکن بیشتر باشد، سرعت حرکت آن در ستون کمتر است. شکل 3 نمونه‌ای را نشان می‌دهد که در آن جزء زرد میل ترکیبی قوی با فاز متحرک دارد و به سرعت در ستون حرکت می‌کند، در حالی که مولفه صورتی میل ترکیبی قوی با فاز ساکن دارد و به آرامی حرکت می‌کند. سرعت شستشو در ستون به میل ترکیبی و فاز ساکن بستگی دارد.

شکل 3-نمونه ای از جداسازی HPLC

 

4-نحوه خواندن کروماتوگرام

کلمه کروماتوگرام به معنای نموداری است که از طریق کروماتوگرافی به دست می آید. شکل 4 نمونه ای از کروماتوگرام را نشان می دهد. کروماتوگرام یک نمودار دو بعدی با محور عمودی است که غلظت را بر حسب شدت سیگنال آشکارساز نشان می دهد و محور افقی نشان دهنده زمان تجزیه و تحلیل است. هنگامی که هیچ ترکیبی از ستون شسته نمی شود، خطی موازی با محور افقی ترسیم می شود. به این خط مبنا می گویند. آشکارساز بر اساس غلظت ترکیب هدف در نوار شستشو پاسخ می دهد. طرح به دست آمده بیشتر شبیه به شکل زنگ است تا مثلث. به این شکل “قله” می گویند.

زمان ماند (tR) فاصله زمانی بین نقطه تزریق نمونه و اوج پیک است. زمان لازم برای ترکیبات باقیمانده (ترکیبات بدون برهمکنش برای فاز ساکن) برای رفتن از انژکتور به آشکارساز را زمان مرده (t0) می گویند.

ارتفاع قله (h) فاصله عمودی بین راس قله و خط پایه است و ناحیه قله (A) که به رنگ آبی روشن رنگ شده است ناحیه محصور شده توسط قله و خط پایه است. این نتایج برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی اجزای یک نمونه استفاده خواهد شد.

---

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC): اصل، انواع، ابزار دقیق و کاربردها

 

کروماتوگرافی تکنیکی برای جداسازی مخلوط مواد به اجزای آنها بر اساس ساختار مولکولی و ترکیب مولکولی آنها است.

این شامل یک فاز ثابت (یک جامد یا مایعی که روی یک جامد قرار دارد) و یک فاز متحرک (مایع یا گاز) است. فاز متحرک در فاز ساکن جریان دارد و اجزای مخلوط را با خود حمل می کند. اجزای نمونه‌ای که برهمکنش‌های قوی‌تری را با فاز ساکن نشان می‌دهند، نسبت به اجزایی با برهمکنش ضعیف‌تر، آهسته‌تر در ستون حرکت می‌کنند.

این تفاوت در نرخ ها باعث جدا شدن اجزای مختلف می شود. جداسازی کروماتوگرافی را می توان با استفاده از انواع فازهای ثابت، از جمله سیلیس تثبیت شده روی صفحات شیشه ای (کروماتوگرافی لایه نازک)، گازهای فرار (کروماتوگرافی گازی) انجام داد.کاغذ (کروماتوگرافی کاغذی) و مایعات (کروماتوگرافی مایع).

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) اساساً یک شکل بسیار بهبود یافته از کروماتوگرافی مایع ستونی است.

به جای اینکه حلال تحت فشار گرانش از طریق ستون چکه کند، تحت فشارهای بالا تا 400 اتمسفر وارد می شود. این باعث می شود سرعت آن بسیار بیشتر شود.

تمام جداسازی های کروماتوگرافی، از جمله HPLC بر اساس یک اصل اساسی عمل می کنند. جداسازی یک نمونه به اجزای تشکیل دهنده آن به دلیل تفاوت در شباهت های نسبی مولکول های مختلف برای فاز متحرک و فاز ساکن مورد استفاده در جداسازی.

انواع HPLC

بسته به سیستم فاز (ایستا) در فرآیند، انواع مختلفی از HPLC وجود دارد:

1. فاز نرمال HPLC

این روش آنالیت ها را بر اساس قطبیت جدا می کند. NP-HPLC از فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیر قطبی استفاده می کند. بنابراین فاز ساکن معمولاً سیلیس است و فازهای متحرک معمولی عبارتند از هگزان، متیلن کلرید، کلروفرم، دی اتیل اتر و مخلوطی از اینها.

بنابراین، نمونه‌های قطبی در سطح قطبی ستون به مدت طولانی‌تر از مواد قطبی کمتر باقی می‌مانند.

2. HPLC فاز معکوس

فاز ثابت ماهیت غیر قطبی (آب گریز) دارد، در حالی که فاز متحرک یک مایع قطبی است، مانند مخلوطی از آب و متانول یا استونیتریل. این ماده بر اساس اصل برهمکنش‌های آبگریز کار می‌کند، از این رو هر چه ماده غیرقطبی‌تر باشد، مدت بیشتری حفظ می‌شود.

3. HPLC بدون اندازه

ستون با موادی با اندازه منافذ دقیقاً کنترل شده پر می شود و ذرات بر اساس اندازه مولکولی آن جدا می شوند. مولکول های بزرگتر به سرعت از طریق ستون شسته می شوند. مولکول های کوچکتر به داخل متخلخل ذرات بسته بندی نفوذ کرده و بعداً شسته می شوند.

4. HPLC تبادل یونی

فاز ساکن دارای یک سطح باردار یونی با بار مخالف با یون های نمونه است. این تکنیک تقریباً به طور انحصاری با نمونه های یونی یا قابل یونیزاسیون استفاده می شود.

هرچه بار روی نمونه قوی‌تر باشد، قوی‌تر به سطح یونی جذب می‌شود و بنابراین زمان بیشتری برای شستشو خواهد داشت. فاز متحرک یک بافر آبی است که در آن از pH و قدرت یونی برای کنترل زمان شستشو استفاده می شود.

 

ابزار دقیق HPLC

همانطور که در نمودار شماتیک در شکل بالا نشان داده شده است، ابزار دقیق HPLC شامل پمپ، انژکتور، ستون، آشکارساز و یکپارچه کننده یا سیستم اکتساب و نمایش است. قلب سیستم ستونی است که در آن جداسازی اتفاق می افتد.

1. مخزن حلال

محتویات فاز متحرک در یک مخزن شیشه ای قرار دارند. فاز متحرک یا حلال در HPLC معمولاً مخلوطی از اجزای مایع قطبی و غیر قطبی است که غلظت های مربوطه آنها بسته به ترکیب نمونه متفاوت است.

2. پمپ

یک پمپ فاز متحرک را از مخزن حلال آسپیره می کند و آن را از طریق ستون و آشکارساز سیستم عبور می دهد. بسته به تعدادی از عوامل از جمله ابعاد ستون، اندازه ذرات فاز ثابت، سرعت جریان و ترکیب فاز متحرک، فشارهای عملیاتی تا 42000 کیلو پاسکال (حدود 6000 psi) می‌تواند تولید شود.

3. انژکتور نمونه

انژکتور می تواند یک تزریق تک یا یک سیستم تزریق خودکار باشد. یک انژکتور برای سیستم HPLC باید تزریق نمونه مایع را در محدوده 0.1-100 میلی لیتر حجم با قابلیت تکرار بالا و تحت فشار بالا (تا 4000 psi) فراهم کند.

4. ستون ها

ستون ها معمولاً از فولاد ضد زنگ صیقلی ساخته می شوند، بین 50 تا 300 میلی متر طول دارند و قطر داخلی آنها بین 2 تا 5 میلی متر است. آنها معمولاً با یک فاز ثابت با اندازه ذرات 3-10 میکرومتر پر می شوند.

ستون هایی با قطر داخلی کمتر از 2 میلی متر اغلب به عنوان ستون های میکرو سوراخ نامیده می شوند. در حالت ایده آل، دمای فاز متحرک و ستون باید در طول تجزیه و تحلیل ثابت نگه داشته شود.

5. آشکارساز

آشکارساز HPLC که در انتهای ستون قرار دارد، آنالیت ها را هنگام شستشو از ستون کروماتوگرافی تشخیص می دهد. آشکارسازهای رایج مورد استفاده عبارتند از طیف سنجی UV، آشکارسازهای فلورسانس، طیف سنجی جرمی و آشکارسازهای الکتروشیمیایی.

6. دستگاه های جمع آوری داده ها

سیگنال‌های آشکارساز ممکن است بر روی ضبط‌کننده‌های نمودار یا یکپارچه‌کننده‌های الکترونیکی جمع‌آوری شوند که از نظر پیچیدگی و توانایی آنها برای پردازش، ذخیره و پردازش مجدد داده‌های کروماتوگرافی متفاوت است. کامپیوتر پاسخ آشکارساز را به هر جزء یکپارچه می کند و آن را در کروماتوگراف قرار می دهد که خواندن و تفسیر آن آسان است.

 

کاربردهای HPLC

اطلاعاتی که می توان با HPLC به دست آورد شامل تفکیک، شناسایی و کمیت یک ترکیب است. همچنین به جداسازی و تصفیه شیمیایی کمک می کند. از دیگر کاربردهای HPLC می توان به موارد زیر اشاره کرد:

کاربردهای دارویی

1. برای کنترل پایداری دارو
2. مطالعه انحلال قرص فرم دوز دارویی.
3. کنترل کیفیت دارویی

کاربردهای زیست محیطی

1. تشخیص ترکیبات فنلی در آب آشامیدنی
2. پایش زیستی آلاینده ها

برنامه های کاربردی در پزشکی قانونی

1. تعیین کمیت داروها در نمونه های بیولوژیکی
2. شناسایی استروئیدها در خون، ادرار و غیره
3. تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی رنگ های نساجی.
4. تعیین کوکائین و سایر مواد سوء مصرف در خون، ادرار و غیره.

غذا و طعم

1. اندازه گیری کیفیت نوشابه و آب.
2. تجزیه و تحلیل قند در آب میوه
3. تجزیه و تحلیل ترکیبات چند حلقه ای در سبزیجات.
4. تجزیه و تحلیل مواد نگهدارنده

کاربرد در تست های بالینی

1. تجزیه و تحلیل ادرار، تجزیه و تحلیل آنتی بیوتیک در خون.
2. تجزیه و تحلیل بیلی روبین، بیلیوردین در اختلالات کبدی.
3. تشخیص نوروپپتیدهای درون زا در مایع خارج سلولی مغز و غیره

---

سوالات متداول

س 1. اصل HPLC چیست؟

اصل HPLC بر اساس توزیع آنالیت بین فاز متحرک و ثابت است.

مهم است که به خاطر داشته باشید که اجزای مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی قبل از جداسازی اجزای نمونه شستشو می‌شوند.

برهمکنش های بین مولکولی بین مولکول های نمونه و مواد بسته بندی، زمان آنها را روی ستون تعیین می کند.

س 2. انواع HPLC چیست؟

چهار نوع اولیه HPLC وجود دارد:

1. HPLC فاز نرمال (روش موثر برای جداسازی طبقات فسفولیپید)
2. HPLC فاز معکوس (متداول ترین روشی که برای جداسازی ترکیباتی که قسمت های آبگریز دارند استفاده می شود)
3. HPLC/کروماتوگرافی غربال مولکولی با حذف اندازه (مورد استفاده در مولکول‌های بزرگ/ مجتمع‌های ماکرومولکولی مانند پلیمرها و پروتئین‌های صنعتی)
4. HPLC تبادل یونی (یون ها و مولکول های قطبی را بر اساس مبدل یونی آنها جدا می کند.

س 3. 4 نوع کروماتوگرافی کدامند؟

چهار نوع کروماتوگرافی هستند

1. کروماتوگرافی مایع (آزمایش آلودگی در نمونه های آب مانند دریاچه ها و رودخانه ها)
2. کروماتوگرافی گازی (تشخیص بمب و مفید در تحقیقات پزشکی قانونی)
3. کروماتوگرافی لایه نازک (برای بررسی خلوص ترکیبات آلی مانند وجود حشره کش یا آفت کش در غذاها استفاده می شود)
4. کروماتوگرافی کاغذی (از یک نوار کاغذ در فاز ساکن استفاده می کند).

س 4. چرا فشار بالا در HPLC مورد نیاز است؟

HPLC از فشار متوسط ​​تا زیاد برای رسیدن به سرعت جریان مطلوب حلال از طریق ستون کروماتوگرافی استفاده می کند زیرا ذرات کوچک مقاومت بیشتری در برابر جریان دارند.

س 5. تفاوت بین ایزوکراتیک و گرادیان چیست؟

برنامه شما می تواند به روش های مختلف اجرا شود – ایزوکراتیک و گرادیان.

ایزوکراتیک زمانی است که مخلوط فاز متحرک در کل زمان آزمایش سازگار باشد. با یک گرادیان، ترکیب مخلوط شوینده در طول اندازه گیری تغییر می کند، که تا حد زیادی بر حفظ آنالیت تأثیر می گذارد. می تواند روند جداسازی را تسریع یا کند کند.

س 6. چه حلالی در HPLC استفاده می شود؟

حلال های مختلفی در HPLC استفاده می شود مانند حلال آبی (آب) و حلال آلی (متانول، استونیتریل و پروپانول). برای بهبود شکل پیک کروماتوگرافی می توان از اسیدهایی مانند اسید استیک، اسید فرمیک، اسید تری فلورواستیک استفاده کرد.

س 7. تفاوت بین آشکارسازهای UV و PDA چیست؟

PDA و UV هر دو آشکارسازهای جذب هستند که حساسیت را برای ترکیبات جذب کننده نور فراهم می کنند. آشکارساز UV بیشتر برای تجزیه و تحلیل HPLC استفاده می شود.

جذب اشعه ماوراء بنفش بر اساس طول موج مورد استفاده متفاوت است، به همین دلیل است که انتخاب طول موج مناسب بر اساس نوع آنالیت مهم است.

از سوی دیگر، آشکارساز PDA یک طول موج بعد سوم اضافه می کند، که راه راحت تری برای یافتن طول موج بدون نیاز به تکرار آنالیز است.

س 8. مزایای HPLC چیست؟

مزایای HPLC به شرح زیر است:

– می تواند هم مواد خام و هم محصولات نهایی را آزمایش کند. – می تواند فرمولاسیون را مهندسی معکوس کند. – در حل مشکلات خرابی محصول مفید است. – می تواند آلاینده ها و سایر ناخالصی ها را تشخیص دهد. – می تواند تجزیه و تحلیل محصول رقیب را انجام دهد. – می تواند محصول را تعیین کند. پایداری و ماندگاری. – آزمایش را می‌توان حتی با یک نمونه کوچک انجام داد. – به شما امکان می‌دهد بسته به سطح کمی‌سازی مورد نیاز، آزمایش را تغییر دهید. – نتایج تولید شده قابل اعتماد هستند. – در توسعه محصولات بهتر مفید است. .– به شما امکان می دهد درک بهتری از محصولات رقیب به دست آورید.

س 9. مقدار Rf چیست؟

در کروماتوگرافی، مقدار RF مربوط به مسافت طی شده یک جزء خاص تقسیم بر مسافت طی شده توسط جبهه حلال است.

به عبارت دیگر، این ویژگی جزء است که در شناسایی اجزا کمک کننده است.

س 10. دو نوع اصلی کروماتوگرافی کدامند؟

انواع مختلفی از کروماتوگرافی وجود دارد اما دو نوع اصلی کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی گازی هستند.

 

جهت کسب اطلاعات بیشتر با شرکت شناسا پرتوژن در ارتباط باشید.

۰۲۱-۲۲۹۱۹۴۷۴
۰۲۱-۲۲۹۱۹۷۲۰