نمای کلی از آنالیز قند با تشخیص الکتروشیمیایی HPLC 

کربوهیدرات هایی مانند قندها یک دسته مهم از مواد برای متابولیسم و تولید انرژی سلول ها هستند. بنابراین، آنها همچنین در علوم دارویی، بیولوژیکی و غذایی نقش اساسی دارند. علاوه بر این، یک روش مترقی علم به سمت تولید انرژی در طبیعت از شکر می رود و سعی می کند سوخت های مدرن و سبز را از مواد خام بیولوژیکی تولید کند. با پرداختن به دستگاه HPLC روش هایی را برای پشتیبانی از این شاخه های مهم علم با وضوح فوق العاده بالا و تجزیه و تحلیل قابل اعتماد توسعه می دهیم.

کربوهیدرات ها اسیدهای ضعیفی با مقدار pKa بین 12 تا 14 هستند. در نتیجه، می توانند در شرایط بازی با pH> 12 به طور کامل یا جزئی یونیزه شوند. با توجه به این شرایط سخت، تنها ستون های تبادل آنیون پلیمری برای تجزیه و تحلیل کربوهیدرات مناسب هستند. زمان بازداری با مقدار pKa همبستگی معکوس دارد و با وزن مولکولی کربوهیدرات به طور قابل توجهی افزایش می یابد.

تشخیص الکتروشیمیایی چه تفاوتی با سایر روش های تشخیص دارد؟ مزایا و محدودیت های استفاده از آشکارسازی الکتروشیمیایی چیست؟

رایج ترین روش های تشخیص در کروماتوگرافی مایع عبارتند از: UV، DAD، فلورسانس و تشخیص MS. با این حال، اکثر کربوهیدرات ها گروه کروموفور ندارند و بنابراین نمی توان آنها را با روش های طیف سنجی جذبی یا انتشاری تشخیص داد. برای استفاده از یکی از این تکنیک های رایج، یک مرحله مشتق سازی قبل یا بعد از ستون ضروری است. این نیاز به تجهیزات ویژه و توسعه روش دارد. اغلب این مشتق‌سازی وضوح جداسازی را بدتر می‌کند. از سوی دیگر، تشخیص MS بسیار مقرون به صرفه است. علاوه بر این، حلال های مورد استفاده برای جداسازی LC شکر اغلب به راحتی تبخیر نمی شوند و بنابراین تشخیص با وضوح بالا را دشوار می کنند.

دتکتور ضریب شکست (RI) جایگزینی برای روش های ذکر شده است که استفاده از آن نیز بسیار آسان است. با این حال، آشکارسازهای RI در تشخیص خود غیر اختصاصی هستند و حساسیت قابل توجهی پایین‌تری دارند و در نتیجه محدودیت‌های تشخیص بدتری (LOD) در مقایسه با سایر روش‌های تشخیص دارند.

جایگزین دیگر تشخیص با دتکتور پراکندگی نور تبخیری (ELSD) است. ELSD نسبت به RID حساس‌تر است، اما نسبت به تشخیص الکتروشیمیایی (ECD) حساسیت کمتری دارد. توسعه روش با ELSD بسیار ساده است تا زمانی که ماده شویش آسان تر از آنالیت ها تبخیر شود. با این حال، برای ELSD یک جریان نیتروژن ثابت و بسیار خالص لازم است، که کاربرد را بسیار پرهزینه می کند.

ECD از این واقعیت استفاده می کند که کربوهیدرات ها در محلول در یک تعادل ردوکس وجود دارند. آمپرومتری از این واقعیت برای تشخیص کمی بسیار حساس استفاده می کند. جریان الکترولیز در یک الکترود کار تحت پتانسیل الکتروشیمیایی پالسی اندازه گیری می شود. جریان الکترولیز متناسب با غلظت آنالیت اکسید شده/کاهش شده است. بسته به آنالیت، حساسیت ECD می تواند 1000 تا 5000 برابر بیشتر از تشخیص RI باشد. از سوی دیگر، تشخیص RI برای استفاده بسیار آسان‌تر است، به چنین زمان‌های تعادل طولانی نیاز ندارد و سلول اندازه‌گیری حساسیت کمتری به تغییرات در روش دارد. با این حال، SenCell حساس در ECD این مزیت را دارد که حجم آن را می توان به صورت جداگانه با شرایط تحلیلی و تا آماده سازی روش LC تطبیق داد.

نمای کلی از سیستم HPLC-ECD AGILENT

این سیستم چه ویژگی هایی را در اختیار محققان قرار می دهد؟

سیستم های AGILENT از ماژول های بیواینرت تشکیل شده است که هیچ سطح فلزی یا شیشه ای در تماس با حلال برای جلوگیری از تشکیل یون های مزاحم ندارند. آنالیز کربوهیدرات ها با یک اتوسمپلر که می‌تواند نمونه‌ها را خنک کند و یک پمپ LPG (شیب فشار کم، چهارتایی) انجام می شود. با این حال، کاربر می تواند با توجه به نیاز خود، بین پمپ های بیواینرت مختلف و روش های تزریق انتخاب کند. قلب سیستم  دتکتور الکتروشیمیایی AGILENT ECD است.دتکتور می‌تواند فلوسل اندازه‌گیری را برای تضمین استحکام روش تعدیل کند. در همان زمان می توان ستون را به آشکارساز متصل کرد. بنابراین، دتکتور همچنین یک ترموستات ستونی است. این باعث کاهش حجم مرده و جلوگیری از گرادیان دما می شود. می توان از انواع مختلف فلوسل برای جابه جایی آمپرومتری پالسی و ثابت به عنوان یک روش تشخیص برای کاربردهای مختلف استفاده کرد،. از دیگر مزایای این فلوسل طول عمر و نظافت آسان آن است که تنها چند دقیقه طول می کشد. در اینجا AGILENT مزایای آشکاری نسبت به سیستم های رقابتی قابل مقایسه دارد.

چه چیزی باعث می شود که سیستم HPLC-ECD  نسبت به تشخیص و انتخاب مواد قابل اکسید شدن و احیا شدن بسیار حساس باشد؟

اول، هر آنالیتی که می تواند اکسید یا احیا شود، گزینه تشخیص الکتروشیمیایی است. آمپرومتری کلاسیک به طور ناپیوسته کار می کند: پر کردن راکتور، اندازه گیری یا تیتراسیون، تخلیه راکتور، تمیز کردن، بازسازی، اندازه گیری بعدی و غیره. یعنی نمی توان آن را در ترکیب با جداسازی HPLC استفاده کرد. سیستم کروماتوگرافی آنالیز قند از HPLC از تشخیص آمپرومتریک پالسی (PAD) از جمله بازسازی الکترود مورد نیاز برای تشخیص قند استفاده می کند. این تکنیک با استفاده از اندازه گیری حجم سل بسیار کوچک، اندازه گیری سریع را تنها در 500 میلی ثانیه امکان پذیر می کند. برای تحقق بالاترین حساسیت تشخیص، از پیکربندی سه الکترود متشکل از یک الکترود کار، یک الکترود مرجع و یک الکترود کمکی استفاده می‌شود. الکترود کمکی دقیقاً در همان پتانسیل الکترود مرجع از طریق یک گیره ولتاژ نگه داشته می شود و هر گونه اثر قطبش را که ممکن است در الکترودها رخ دهد جبران می کند. همراه با حجم بسیار کوچک سل SenCell، که می تواند به طور متغیر بین 0 تا 300 nL تنظیم شود، Agilent ECD حتی برای برنامه های (U)HPLC بسیار مناسب است.

شکل موج پتانسیل PAD 4 مرحله ای برای تشخیص مونوساکاریدها و سایر کربوهیدرات ها. تشخیص نمونه در طول دوره زمانی مشخص شده t رخ می دهد.

 آنالیز کربوهیدرات در کجا استفاده می شود و چرا داشتن سطح قند شناخته شده در محصولات تولید شده مهم است؟

مونو و پلی ساکاریدها، یعنی کلاس های مختلف قندها، از نظر خواص بسیار متنوع هستند. به دلیل حلالیت در آب، فراهمی زیستی خوبی دارند و عموماً غیر سمی هستند. در صنعت داروسازی، شکر نه تنها به عنوان یک ماده فعال، بلکه به عنوان پرکننده در قرص ها یا به عنوان افزودنی در آب میوه ها نیز استفاده می شود. در صنایع غذایی، قندها به عنوان شیرین کننده و همچنین به عنوان تثبیت کننده به شکل نشاسته استفاده می شود. تقریباً هیچ غذایی وجود ندارد که حاوی نوعی قند نباشد. تولیدکنندگان در صنایع دارویی و غذایی باید اطلاعات دقیقی در مورد ماهیت و ترکیب مواد تشکیل دهند. برای این منظور روش‌های تحلیلی مهم است که می‌تواند همه انواع قندها را به‌طور بسیار حساس و قابل اعتماد اندازه‌گیری کند.

با نگاهی خاص به صنعت غذا و نوشیدنی، چگونه می توان از سیستم  HPLC-ECD Agilent برای شناسایی قندهای مختلف، به عنوان مثال جداسازی گلوکز، فروکتوز و لاکتوز استفاده کرد؟

تشخیص گلوکز، فروکتوز و لاکتوز از یکدیگر اساساً بسیار ساده است. معمولاً از ستون های تبادل یونی برای آنالیز قند استفاده می شود. در ترکیب با تشخیص الکتروشیمیایی، البته باید مراقب بود که مواد ستون نیز در حالت اولیه پایدار باشد. به عنوان مثال، ستون Eurokat Na که با محلول هیدروکسید سدیم نیز اصلاح شده است، در اینجا توصیه می شود.

کیفیت غذا مانند خواص فیزیکی و شیمیایی غذاها مانند شیرینی، ظاهر، پایداری و بافت به نوع و غلظت کربوهیدرات های موجود بستگی دارد. با این حال، برای بسیاری از سوالات در صنایع غذایی، تشخیص با یک آشکارساز RID کافی است. در برخی موارد، به عنوان مثال، اتحادیه اروپا یا FDA مقادیر بسیار پایینی را تجویز می کنند که در نتیجه آشکارساز AGILENT ECD انتخاب مناسبی است. یکی از این نمونه ها لاکتوز موجود در محصولات بدون لاکتوز است. بنابراین، حد تشخیص تجویز شده 10 میلی گرم در 100 گرم به راحتی قابل دستیابی است و با LOD 1.5 میکروگرم در 100 گرم، بسیار کمتر است. این به سازنده و کاربر نهایی ایمنی لازم را می دهد.

چرا آنالیز  قندها برای صنعت داروسازی مهم است؟

مواد موثره بر پایه قند وجود دارد. به عنوان مثال، آنتی بیوتیک های جدید از الیگومرهای قند جالب هستند، یا زمانی که شکر در ترکیب با مولکول های دیگر مانند لیپیدها یا پروتئین ها برای به دست آوردن کلاس های جدید از مواد فعال استفاده می شود. به عنوان مثال، گلیکوپروتئین ها، گلیکولیپیدها و پروتئوگلیکان ها هستند مخصوصا برای مثال، ترکیب پروتئین ها با قندها می تواند متابولیسم را بهبود بخشد. یک روش تحلیلی با وضوح بالا به ویژه برای نظارت بر غلظت کم مواد فعال در ارگانیسم یا برای شناسایی محصولات متابولیک مهم است.

آنالیز قند چگونه بر تولید و پالایش سوخت زیستی تأثیر می گذارد؟

در زمان بحران آب و هوا و کمبود مواد خام، تحقیقات به دنبال جایگزین‌های جدیدی برای سوخت‌های موثر سبز هستند. تاکنون سوخت‌های زیستی عمدتاً از غلات یا ذرت تولید می‌شوند و بنابراین در رقابت با تولید مواد غذایی هستند. علاوه بر ضایعات علف و مواد غذایی، تمرکز بر ضایعات چوب به عنوان منبع مواد خام جایگزین برای تولید سوخت زیستی است. صرف نظر از منبع، زیست توده ها، غنی از سلولز، همیشه از نظر حرارتی یا شیمیایی تجزیه می شوند و سپس برای به دست آوردن قندهای پایین تر یا مونومر به صورت آنزیمی تخمیر می شوند. در مورد چوب، قندهای فوکوز، رامنوز، آرابینوز، گالاکتوز، گلوکز، زایلوز و مانوز و همچنین اسیدهای قندی اسید گالاکترونیک و اسید گلوکورونیک تولید می شوند. ارزیابی کمی از محصولات تجزیه برای ارزیابی فرآیند به منظور محاسبه اثربخشی استفاده از مواد خام بسیار مهم است. این به این دلیل است که نسبت کربوهیدرات های مختلف با بازده بیواتانول تولید شده از این قندها در مرحله بعدی نسبت مستقیم دارد. علاوه بر پایایی روش تحلیلی برای بررسی قندهای چوب با تشخیص الکتروشیمیایی، که در یک برنامه کاربردی ، استفاده از حلالهای آبی نیز گویای استفاده در این زمینه تحقیقاتی بسیار اکولوژیکی است.

کروماتوگرام مخلوط استاندارد حاوی 0.1 میلی گرم در میلی لیتر فوکوز (1)، رامنوز (2)، آرابینوز (3)، گالاکتوز (4)، گلوکز (5)، زایلوز (6)، مانوز (7)، اسید گالاکتورونیک (8) و اسید گلوکورونیک (9). و برای اسیدهای اورونیک روی قله ها زوم کنید.

آینده HPLC-ECD و سیستم های آنالیز کربوهیدرات از چیست؟

در حال حاضر ما در حال آزمایش انواع ستون های مختلف برای افزایش تنوع روش ها برای سیستم اجیلنت هستیم. ما همچنین در حال بررسی زمینه های کاربردی جدید هستیم. به عنوان مثال، گلوتامات ها، کورتیزون ها یا افزودنی های مبتنی بر پلی فنل برای صنایع غذایی جالب هستند. برای صنعت داروسازی، به عنوان مثال، آمینوگلیکوزیدها موضوع جالبی برای تحقیقات آنتی بیوتیکی هستند که با تشخیص الکتروشیمیایی می توان به خوبی به آن پرداخت.

جهت مشاوره و خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی با مشاوران واحد فروش شرکت شناسا پرتوژن ۷۵۳۱۱ – ۰۲۱ در ارتباط باشید.