انواع فازهای ساکن ستون HPLC
“تحصیلات رسمی کمک میکند امرار معاش کنید، ولی آموزشهای شخصی شما را ثروتمند میکند.”
جیم ران
در بخش 1، قیاسی انجام شد که مخلوط مولکولی را به خانوادهای شبیه میدانست که در حال عبور از یک مغازهی آبنبات فروشی (فاز ساکن) هستند. از آنجا که کودکان به آبنبات علاقه دارند مایلند در آنجا بمانند، در حالی که والدین مانند مولکولهای نگه داشته نشده به حرکت خود ادامه میدهند که منجر به جداشدن فرزندان از والدین میشود! جزءبندی مولکولهای نمونه میان فاز متحرک و فاز ساکن در ستون HPLC بر اساس میل های ترکیبی ای است که برخی از مولکولها را عقب نگاه میدارد، در حالی که به باقی آنها اجازه میدهد تا آزادانه عبور کنند.
فاز ساکن ستون HPLC جایی است که جداسازی در آن رخ میدهد و مهمترین بخش سیستم است. انواع مختلف تجزیه و تحلیل، بر اساس نوع فاز ساکن و مکانیسم جداسازی در ستون طبقه بندی میشوند.
اساساً تعاملات بر سه نوع است:
- تعاملات قطبی
اختلاف در قطبیت میان اجزای نمونه و ماهیتهای پیوندی در فاز ساکن، که به بازداری ترجیحی منجر میشود.
- تعاملات یونی
جداسازی بر اساس ویژگیهای بار مولکولهای نمونه. یون های آنالیت به مراکز یونی با بار مخالف در فاز ساکن تمایل دارند.
- اندازه ی مولکولی
جداسازی به علت گیرانداختن مولکولهای کوچک در منافذ فاز ساکن رخ میدهد. ابتدا مولکولهای بزرگ عبور میکنند و سپس مولکولهای کوچکتر که گیر افتاده اند، شسته میشوند.
اکنون ما به طور خلاصه انواع جداسازی HPLC را بر اساس چنین تعاملاتی مورد بحث قرار میدهیم.
جداسازی HPLC فاز معکوس
اغلب کاربردهای HPLC تحت کروماتوگرافی فاز معکوس قرار میگیرند. فازهای ساکن غالباً از هیدروکربن های آلکیل غیرقطبی مانند زنجیرههای C-8 یا C-18 تشکیل شده اند که به سیلیس یا سایر تکیه گاه های بی اثر متصل شده اند. ستونهای C18 در حقیقت میتوانند بیش از 60% از کاربردهای مورد نیاز در اغلب آزمایشگاههای HPLC را برآورده کنند. فاز متحرک قطبی است و ترتیب شویش بر اساس ترکیبات قطبی، و سپس ترکیباتی با قطبیت کمتر و در انتها ترکیباتی با قطبیت ضعیف یا غیر قطبی است.
جداسازی HPLC فاز نرمال
جداسازی فاز نرمال، معکوس جداسازی فاز معکوس است. فازهای ساکن قطبی بوده و از سیلیس ساده یا ترکیبات آلی مانند آمینو، سیانو و غیره تشکیل شده اند، یعنی گروه هایی که به تکیه گاه های مبتنی بر سیلیس متصل شده اند. فازهای متحرک غیرقطبی هستند، مانند هگزان، هپتان و غیره، با مقادیر کمی از تعدیل کننده های قطبی مانند متانول، اتانول، ایزوپروپانول و غیره. ترتیب شویش بر اساس مولکولهای غیرقطبی، و سپس مولکولهایی با قطبیت ضعیف و در انتها مولکولهای قطبی است.
کروماتوگرافی تبادل یونی
معمولاً از رزین های آلی مصنوعی یا ترکیبات قابل یونیزاسیون محلول در آب برای جداسازی استفاده میشود. مبدلهای آنیونی دارای مراکز مثبت در سطح خود هستند و برای جداسازی ترکیبات حاوی گروههای سولفونات، فسفات یا کربوکسیلات استفاده میشوند. مبدلهای کاتیونی دارای مراکز منفی در سطح خود هستند و برای جداسازی ترکیبات پایه مانند آمینها استفاده میشوند. استایرن دی وینیل بنزن با اتصالات عرضی، یک ماده ی پایه ی معمولی با گروههای بارداری است که به حلقه های فنیل متصل شده اند. بارهای روی مواد پُرکننده، مولکولهایی با بار مخالف را از فاز متحرک جذب میکنند و آنها را با ترتیبِ معکوس نیروهای جاذبه آزاد میکنند. جداسازی اجزا را میتوان با کنترل pH فاز متحرک، دما، ترکیب یونی و افزودن تعدیل کننده ها کنترل کرد.
کروماتوگرافی اندازه طردی
جداسازی بر اساس اندازه ی مولکولی مولکول ها صورت میگیرد. مولکولهای کوچک در منافذ فاز ساکن گیر افتاده و پس از مولکولهای بزرگ خارج میشوند. هیچ نیروی شیمیایی یا یونی در فرایند جداسازی دخیل نیست. چنین فازهایی با بنیان های سیلیس یا زیرکونیوم و پلیمرهایی با اتصالات عرضی سنگین در دسترس هستند و برای جداسازی مولکولهای بزرگی مانند پلی ساکاریدها، پپتیدها، پروتئینها و پلیمرها استفاده میشوند.
طول ستون با فاز ساکنِ یکسان تأثیر قابل توجهی بر فرآیند جداسازی دارد. ستونهای عریض و طویل میتوانند بارهای بیشتری از نمونه را در خود جای داده و تفکیک پذیری بالاتری را ارائه دهند. از سوی دیگر، ستونهای کوتاهتر زمان آنالیز و در نتیجه مصرف فاز متحرک را کاهش میدهند.
پس از شناخت فاز ساکن، لازم است فاز متحرک را شناخت که اساساً برای حمل نمونه در سیستم HPLC مورد استفاده قرار میگیرد.
نکته
هرگز از ستون به عنوان همزن استفاده نکنید و مراقب باشید تا در معرض شوک مکانیکی قرار نگیرد، زیرا در این صورت ممکن است عمل پُرکردن ستون به طور برگشت ناپذیری مختل شود.
بخش بعدی انواع فازهای متحرک را به شما معرفی میکند.
