اصول ، نحوه کارکرد ، انواع و کاربرد دستگاه PCR

پرتوژن ۱۴۰۱/۰۷/۱۸
نحوه کار انواع و کاربرد دستگاه PCR

اصول ، نحوه کارکرد ، انواع و کاربرد دستگاه PCR

 

اصول و نحوه کارکرد دستگاه PCR

PCR تکنیک آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی مدرن است.

اگر نیاز به کپی، توالی یا تعیین کمیت DNA دارید، باید PCR را بدانید. اما چگونه می توان با PCR شروع کرد؟

به طور خلاصه، PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یک تکنیک بیوشیمیایی است که از ترموسایکلینگ و آنزیم ها برای کپی سریع و مطمئن DNA استفاده می کند.

این مقاله یک مرور مختصر از فرآیند PCR ارائه می‌کند و چند نکته برای جلوگیری از رایج‌ترین مشکلات به شما کمک می‌کند.

اگر در زمینه PCR نسبتاً جدید هستید، این برای شما مناسب است. (و حتی اگر در PCR باتجربه باشید، ارزش خواندن را دارد تا شاید یک یا دو نکته را بگیرید!)

با PCR شروع کنید: 5 ماده مورد نیاز

  1. پلیمراز

پلیمرازها آنزیم هایی هستند که در شرایط مناسب می توانند رشته های جدیدی از DNA را از DNA الگو و نوکلئوتیدها جمع آوری کنند. واکنش PCR اولیه دشوار بود زیرا دمای بالای مورد نیاز برای دناتوره کردن DNA باعث از بین رفتن پلیمرازها می شد.

این بدان معنی بود که پس از هر چرخه گرمایش، پلیمرازهای جدید باید به صورت دستی به واکنش اضافه می شد (تلاشی گران قیمت).

با این حال، در PCR مدرن، این مشکلی نیست، زیرا پلیمرازها معمولاً از یکی از دو منبع باکتری های گرمادوست می آیند:

  1. Thermus aquaticus
  2. Pyrococcus furiosus.

این پلیمرازها که به ترتیب با نام های Taq (تلفظ “tack”) و Pfu (تلفظ “PFU”) شناخته می شوند، می توانند به راحتی دماهای بالای مرتبط با PCR را تحمل کنند.

پلیمرازهای تجاری Taq و Pfu برای سرعت، وفاداری، پردازش (قابلیت کامل خواندن طولانی) و توانایی آنها برای خواندن الگوهای غنی از GC مهندسی شده اند.

شرکت ها به طور مداوم در حال توسعه پلیمرازهای جدید هستند. بنابراین، به “هر چیزی که در فریزر شماست” بسنده نکنید، بلکه بهترین پلیمراز تجاری را برای نیازهای PCR خود خریداری کنید.

با نماینده فروش محلی خود نیز صحبت کنید، زیرا آنها اغلب می توانند نمونه های پلیمراز رایگان ارائه دهند، بنابراین شما می توانید تصمیم بگیرید که چه چیزی برای شما بهترین است.

  1. DNA الگو

این DNA است که پلیمراز شما می خواند و کپی می کند. DNA الگوی شما می تواند ژنومی، پلاسمید یا cDNA باشد، اما منبع شما هر چه باشد، کیفیت آن مهم است.

هرچه DNA الگوی شما سالم تر و خالص تر باشد، دریافت نتایج PCR خوب آسان تر است.

همچنین، به خاطر داشته باشید که مقدار ایده‌آل DNA به منبع شما بستگی دارد، اما معمولاً ۱ تا ۱ نانوگرم DNA پلاسمید یا ۱ نانوگرم تا ۱ میکروگرم DNA ژنومی در هر PCR است.

  1. پرایمرها

پرایمرها قطعات کوتاهی از DNA سنتز شده هستند که به DNA الگوی شما متصل می شوند. شما باید یک پرایمر “به جلو” و یک آغازگر “معکوس” طراحی کنید.

  • پرایمر فوروارد شما شروع PCR شما را مشخص می کند. توالی این پرایمر با توالی DNA الگوی 5´-3′ شما یکسان است.
  • پرایمر معکوس شما انتهای PCR شما را مشخص می کند. توالی این پرایمر مکمل معکوس DNA الگوی شماست.

به طور کلی، پرایمرها 18-22 جفت پایه طول دارند. با این حال، مهمتر از طول آنها، دمای ذوب آنها است.

دمای ذوب پرایمرهای شما باید 54 تا 60 درجه سانتیگراد و تا حد امکان مشابه یکدیگر باشد.

تعداد زیادی ماشین های آنلاین وجود دارد که می تواند دمای بازپخت پرایمر را تعیین کند و اکثر شرکت هایی که پرایمرهای سنتز می کنند، چنین ماشین هایی را هم را عرضه می کنند.

  1. نوکلئوتیدها

نوکلئوتیدها به عنوان مونومرهای DNA برای ساختن کپی DNA ضروری هستند. برای اکثر DNA PCR ها از دئوکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTPs) استفاده خواهید کرد. می‌توانید اینها را جداگانه یا به‌صورت ترکیبی dGTP، dCTP، dATP و dTTP خریداری کنید.

هرچه بخرید، به خاطر داشته باشید که نوکلئوتیدها به چرخه های انجماد/ذوب بسیار حساس هستند. بنابراین، بهتر است مقدار کمی از dNTP های خود را ایجاد کنید.

همچنین، مطمئن شوید که dNTP ها را به درستی ذخیره می کنید – از فریزر بدون برفک که چرخه های یخ زدایی خودکار را پشت سر می گذارد، استفاده نکنید.

  1. بافر

بیشتر پلیمرازهای تجاری با بافر ایده آل خود عرضه می شوند. این بافرها نه تنها موارد صحیح را تامین می کنند pH، اما همیشه دارای افزودنی هایی مانند منیزیم، پتاسیم یا DMSO هستند که به بهینه سازی دناتوره شدن DNA، تغییر طبیعت و فعالیت پلیمراز کمک می کنند.

 

ترموسایکلینگ

این جایی است که کپی اتفاق می افتد. تمام مواد فوق به یک لوله PCR اضافه شده و لوله ترموسایکل می شود.

برای دستیابی به ترموسایکل زمانی که PCR برای اولین بار اختراع شد، لوله های PCR جداگانه به صورت دستی بین حمام های آب گرم منتقل شدند.

اما از زمان اختراع ”  Mr. Cycle اولین دستگاه ترموسایکلینگ، تنظیم دما اکنون به صورت خودکار توسط ترموسایکلرها انجام می شود.

  1. مقداردهی اولیه

در این مرحله، واکنش به مدت 30 ثانیه تا چند دقیقه در دمای 94-96 درجه سانتیگراد گرم می شود. این مرحله معمولاً فقط یک بار در همان ابتدای واکنش PCR انجام می شود.

در این مرحله برای فعال کردن پلیمرازهای شروع و برای دناتوره کردن DNA الگوی شما مهم است.

  1. دناتوراسیون (تکرار 15 تا 40 بار)

در این مرحله، واکنش به مدت 15 تا 30 ثانیه تا دمای 94-98 درجه سانتیگراد گرم می شود. این مرحله DNA و پرایمرهای شما را دناتوره می کند، که به آنها اجازه می دهد در مرحله بعدی به یکدیگر اتصال شوند.

  1. اتصال (تکرار 15-40 بار)

در این مرحله، دمای واکنش شما به سرعت به 50-64 درجه سانتیگراد برای 20-40 ثانیه کاهش می یابد.

دما در این مرحله باید به اندازه‌ای پایین باشد که پرایمرهای دناتوره‌شده شما بتوانند جفت‌های باز واتسون-کریک را با DNA الگوی شما تشکیل دهند، اما به اندازه‌ای بالا باشد که فقط پایدارترین (کاملاً جفت‌شده) ساختارهای DNA دو رشته‌ای تشکیل شوند.

معمولاً این دمای اتصال عالی چند درجه کمتر از دمای ذوب جفت پرایمر شما است.

همچنین در طی این مرحله، پلیمراز شما به کمپلکس DNA پرایمر/الگوی شما متصل می شود، اگرچه پلیمراز شما شروع به خواندن نمی کند تا زمانی که دما در مرحله بعدی افزایش یابد.

  1. ازدیاد طول یا امتداد (تکرار 15-40 بار)

در این مرحله واکنش شما به سرعت تا دمای 72 تا 80 درجه سانتیگراد گرم می شود. این زمانی است که پلیمراز شما شروع به خواندن (در جهت 5′-3′) و کپی کردن DNA الگوی شما (در جهت 3′-5′) می کند.

دمای بالاتر در طول این مرحله برهمکنش‌های غیراختصاصی پرایمر/الگوی DNA را کاهش می‌دهد و در نتیجه ویژگی واکنش شما را افزایش می‌دهد.

با این حال، درجه حرارت دقیق با ترجیح پلیمراز شما تعیین می شود، بنابراین بسته بندی خود را بخوانید. طول این مرحله بستگی به طول کپی DNA شما دارد.

به طور معمول، DNA پلیمراز می تواند 1000 جفت باز در دقیقه کپی کند. بنابراین، باید حداقل 1 دقیقه زمان تمدید در هر 1000 پایه را در نظر بگیرید.

در پایان این جوجه کشی، قطعات دو رشته ای جدیدی از DNA ایجاد خواهد شد که از هر دو الگو و DNA جدید تشکیل شده است.

  1. و تکرار کنید

مراحل 2-4 سپس 15-40 بار تکرار می شوند.

درست است که هرچه چرخه های بیشتری برنامه ریزی کنید، کپی های DNA بیشتری ایجاد خواهید کرد. با این حال، یک حد بالایی وجود دارد.

در برخی مواقع نوکلئوتیدهای آزاد موجود محدود می شوند و کپی های DNA زودرس کوتاه شده می توانند مشکل ساز شوند.محصول کمتری که خوب و تمیز باشد به مقدار زیادی محصول کثیف ارجحیت دارد.

  1. کشیدگی نهایی

این یک مرحله اختیاری در فرآیند PCR است اما اغلب توصیه می شود. در این مرحله واکنش برای چند دقیقه در دمای 70-74 درجه سانتیگراد نگه داشته می شود. (معمولاً از همان دمایی که در مرحله Elongation یا Extension استفاده کرده اید استفاده می کنید.)

این مرحله به پلیمرازها اجازه می‌دهد تا خواندن هر رشته‌ای را که در حال حاضر روی آن هستند به پایان برسانند. این مرحله اختیاری می تواند به کاهش تعداد کپی های کوتاه شده در محصول نهایی شما کمک کند.

  1. برگزاری نهایی

واکنش شما اکنون کامل است. از آنجایی که کل فرآیند PCR می‌تواند چند ساعت طول بکشد، PCR اغلب یک شبه یا زمانی که شما کنار گذاشته‌اید انجام می‌شود. توصیه می شود ترموسایکلر خود را طوری برنامه ریزی کنید که محصول PCR شما را تا زمان بازگشت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگه دارد.

سپس می توانید محصول خود را تجزیه و تحلیل یا استفاده کنید، یا آن را به انبارهای طولانی مدت مناسب تری مانند یخچال خود منتقل کنید.

 

کاربردهای دستگاه PCR

 

  1. تشخیص بیماری عفونی، پیشرفت، و پاسخ به درمان

فناوری PCR تشخیص DNA یا RNA ارگانیسم‌های بیماری‌زا را تسهیل می‌کند و به این ترتیب، به آزمایش‌های تشخیصی بالینی برای طیف وسیعی از عوامل عفونی مانند ویروس‌ها، باکتری‌ها، تک یاخته‌ها و غیره کمک می‌کند. که پاسخ ایمنی بدن به یک پاتوژن را تعیین می کند. به طور خاص، آزمایش‌های مبتنی بر PCR برای تشخیص حضور عامل بیماری‌زا پیشاپیش نسبت به روش‌های مبتنی بر سرولوژی صلاحیت دارند، زیرا بیماران ممکن است هفته‌ها طول بکشد تا آنتی‌بادی‌هایی را علیه یک عامل مسری ایجاد کنند. آزمایش‌های مبتنی بر PCR برای شمارش میزان ویروس در خون فرد (بار ویروسی) ایجاد شده‌اند که به پزشکان اجازه می‌دهد پیشرفت بیماری و پاسخ بیمار به درمان را بررسی کنند. این پتانسیل باورنکردنی برای بهبود مدیریت بالینی بیماری های ناشی از عفونت ویروسی، از جمله ایدز و هپاتیت، ارزیابی بار ویروسی در طول درمان و بعد از درمان دارد. همچنین از روش PCR برای بررسی آلودگی مایکوپلاسم در رده های سلولی پستانداران استفاده می شود.

  1. تشخیص بیماری های ژنتیکی

استفاده از PCR در تشخیص بیماری های ژنتیکی، چه به دلیل تغییرات ژنتیکی ذاتی و چه در نتیجه جهش های ژنتیکی طبیعی، رو به افزایش است. ناهنجاری حتی قبل از تولد نیز قابل تشخیص است. چندشکلی ترکیبی تک رشته ای (SSCP)، یا چندشکلی زنجیره ای تک رشته ای، به عنوان تفاوت ساختاری توالی های نوکلئوتیدی تک رشته ای با طول یکسان که توسط تفاوت در توالی ها در شرایط تجربی خاص ایجاد می شود، تعریف می شود. این روزها SSCP به عنوان یک ابزار تشخیصی در زیست شناسی مولکولی بیشترین کاربرد را دارد. می توان از آن در ژنوتیپ برای تشخیص افراد هموزیگوت با حالت های آللی مختلف و همچنین افراد هتروزیگوت که انحرافات ژنتیکی را به ارث می برند استفاده کرد.

  1. مشاوره ژنتیک

این کار برای والدین انجام می شود که از قبل حساب بیماری ژنتیکی را بررسی کنند تا در مورد بچه دار شدن تصمیم بگیرند. این البته توسط قوانین و دستورالعمل های ملی اداره می شود. تشخیص بیماری ژنتیکی قبل از کاشت جنین در IVF (لقاح آزمایشگاهی) که به عنوان تشخیص قبل از لانه گزینی نیز شناخته می شود، با استفاده از روش مبتنی بر PCR قابل انجام است. علاوه بر تشخیص بیماری ارثی یا خودبخودی، روش مبتنی بر PCR اعم از علامتی یا بدون علامت (به دلیل سابقه خانوادگی مانند دیستروفی عضلانی دوشن) بسیار مفید است.

  1. علوم پزشکی قانونی

اثر انگشت DNA یکی از پرکاربردترین کاربردهای PCR (همچنین به عنوان پروفایل DNA شناخته می شود) است. پروفیل های کشش های خاصی از DNA در انگشت نگاری ژنتیکی استفاده می شود (به طور کلی 13 جایگاه مقایسه می شود) که از فردی به فرد دیگر متفاوت است. PCR همچنین نقشی در تجزیه و تحلیل DNA ژنومی یا میتوکندری ایفا می کند، که در آن محققان از نمونه هایی از ساقه مو و استخوان زمانی که نمونه های دیگر در دسترس نیستند استفاده می کنند.

  1. تحقیق در زیست شناسی مولکولی

PCR یک تکنیک ضروری در روش شبیه سازی است که امکان تولید مقادیر زیادی DNA خالص از مقدار کمی از رشته الگو و مطالعه بیشتر یک ژن خاص را فراهم می کند. برخی از تغییرات در پروتکل PCR می‌توانند جهش‌هایی (عمومی یا جهت‌دار) در یک توالی یا توسط یک قطعه درج شده یا تغییر پایه ایجاد کنند. PCR برای مکان‌های برچسب‌گذاری شده با توالی (STS) به‌عنوان نشانگر وجود بخش خاصی از ژنوم در یک کلون خاص استفاده می‌شود. یکی از کاربردهای رایج Real-time PCR مطالعه الگوهای بیان ژن ها در مراحل مختلف رشد است. PCR همچنین می تواند بررسی کند‗ON یا OFF’ ژن های خاص در مراحل مختلف بافت (یا حتی در سلول های فردی).

  1. دیگر موارد

PCR کاربردهای متعددی در زمینه های مختلف دارد. پروژه ژنوم انسانی (HGP) برای تعیین توالی 3 میلیارد جفت باز در ژنوم انسان، به شدت بر PCR متکی بود. ژن های مرتبط با انواع بیماری ها با استفاده از PCR شناسایی شده اند. به عنوان مثال، دیستروفی عضلانی دوشن، که در اثر جهش ژنی ایجاد می‌شود که با تکنیک PCR به نام Multiplex PCR شناسایی می‌شود. PCR می تواند به بررسی DNA موجودات مختلف مانند ویروس ها یا باکتری ها کمک کند. PCR برای شناسایی و کشف روابط بین گونه ها در زمینه زیست شناسی تکاملی استفاده شده است. در انسان شناسی نیز برای درک الگوهای مهاجرت انسان باستانی استفاده می شود. در باستان شناسی، از آن برای شناسایی نژاد بشر باستان استفاده شده است.

مشاهده
کروماتوگرافی گازی (GC) چگونه می تواند به آلودگی کمک کند؟

 

ترمال سایکلر trident healforceجهت مشاهده فروشگاه دستگاه ترمال سایکلر لطفا کلیک فرمایید.

 

 انواع دستگاه PCR

 

  1. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR
  2. Allele-specific PCR
  3. Alu PCR
  4. Assembly PCR
  5. Asymmetric PCR
  6. COLD PCR
  7. Colony PCR
  8. Conventional PCR
  9. Digital PCR (dPCR)
  10. Fast-cycling PCR
  11. High-fidelity PCR
  12. High-Resolution Melt (HRM) PCR
  13. Hot-start PCR
  14. In situ PCR
  15. Intersequence-specific (ISSR) PCR
  16. Inverse PCR
  17. LATE (linear after the exponential) PCR
  18. Ligation-mediated PCR
  19. Long-range PCR
  20. Methylation-specific PCR (MSP)
  21. Miniprimer PCR
  22. Multiplex-PCR
  23. Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR)
  24. Nested PCR
  25. Overlap extension PCR
  26. Real-Time PCR (quantitative PCR or qPCR)
  27. Repetitive sequence-based PCR
  28. Reverse-Transcriptase (RT-PCR)
  29. Reverse-Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR)
  30. RNase H-dependent PCR (rhPCR)
  31. Single cell PCR
  32. Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR)
  33. Solid phase PCR
  34. Suicide PCR
  35. Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)
  36. Touch down (TD) PCR
  37. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR

 

 

  1. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR
  •  PCR یک تکنیک مبتنی بر استفاده از تقویت انتخابی بخشی از قطعات DNA هضم شده برای تولید اثر انگشت منحصر به فرد برای ژنوم مورد نظر.
  • این تکنیک می تواند به سرعت تعداد زیادی از قطعات نشانگر را برای هر ارگانیسمی، بدون اطلاع قبلی از توالی ژنومی، تولید کند.
  • AFLP PCR از آنزیم های محدود کننده برای هضم DNA ژنومی استفاده می کند و امکان اتصال آداپتورها به انتهای چسبنده قطعات را فراهم می کند.
  • سپس بخشی از قطعات محدود کننده برای تقویت با استفاده از پرایمرهایی که مکمل توالی آداپتور هستند انتخاب می شود.
  • توالی های تقویت شده جدا شده و در دناتوره شدن در الکتروفورز ژل آگارز مشاهده می شوند.
  • AFLP PCR برای انواع کاربردها، به عنوان ارزیابی تنوع ژنتیکی در گونه ها یا در میان گونه های نزدیک، برای استنتاج فیلوژنی در سطح جمعیت و الگوهای جغرافیایی زیستی، برای تولید نقشه های ژنتیکی و تعیین ارتباط بین ارقام استفاده می شود.

 

  1. Allele-specific PCR
  • واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اختصاصی آلل (AS-PCR) تکنیکی مبتنی بر آغازگرهای اختصاصی آلل است که می‌توان از آن برای تجزیه و تحلیل پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی استفاده کرد.
  • PCR اختصاصی آلل (Amplification Refractory Mutation System) ARMS-PCR نیز نامیده می شود که مربوط به استفاده از دو پرایمر مختلف برای دو آلل مختلف است.
  • یکی مجموعه پرایمرهای جهش یافته ای است که نسبت به PCR معمولی مقاوم (مقاوم) هستند و دیگری مجموعه پرایمرهای معمولی هستند که در برابر واکنش PCR جهش یافته مقاوم هستند.
  • انتهای 3 این پرایمرها به گونه‌ای اصلاح می‌شوند که یک مجموعه از آغازگر می‌تواند آلل طبیعی را تقویت کند در حالی که سایرین آلل جهش یافته را تقویت می‌کنند.
  • این عدم تطابق به پرایمر اجازه می دهد تا یک آلل واحد را تقویت کند.
  • این به طور گسترده ای در تشخیص جهش یک نقطه ژنی مانند کم خونی سلول داسی شکل و تالاسمی استفاده می شود.
  • همچنین برای تعیین مستقیم ژنوتیپ های گروه خونی ABO استفاده می شود.

 

  1. Alu PCR
  • Alu PCR یک تکنیک انگشت نگاری DNA سریع و آسان است که بر اساس تجزیه و تحلیل همزمان بسیاری از مکان های ژنومی احاطه شده توسط عناصر تکراری Alu است.
  • عناصر Alu امتداد کوتاهی از DNA هستند که در ابتدا با عملکرد اندونوکلئاز محدود کننده آرتروباکتر لوتئوس (Alu) مشخص می شوند.
  • عناصر Alu یکی از فراوان ترین عناصر قابل انتقال هستند و در سرتاسر ژنوم انسان یافت می شوند و در تکامل نقش دارند و به عنوان نشانگرهای ژنتیکی استفاده می شوند.
  • در Alu PCR، دو پرایمر نشاندار شده با فلوئوروکروم مکمل آن توالی ها برای انجام PCR استفاده می شود و سپس محصولات PCR توسط آنالیز می شوند.
  • درج Alu در چندین بیماری ژنتیکی انسانی و انواع سرطان استفاده شده است. بنابراین، این PCR نقش اساسی در تشخیص این بیماری ها و جهش ها دارد.

 

  1. Assembly PCR
  • مونتاژ PCR روشی برای جمع آوری الیگونوکلئوتیدهای DNA بزرگ از چند قطعه کوتاه تر است.
  • در PCR، اندازه الیگونولئوتیدهای مورد استفاده 18 جفت باز است، در حالی که در مونتاژ طول PCR تا 50 جفت باز برای اطمینان از هیبریداسیون صحیح استفاده می شود.
  • در طی چرخه های PCR، الیگونوکلئوتیدها به قطعات مکمل متصل می شوند و سپس توسط آنزیم پلیمراز پر می شوند.
  • بنابراین، هر چرخه این PCR بسته به اینکه کدام اولیگونوکلئوتیدها یکدیگر را پیدا کنند، طول قطعات مختلف را به طور تصادفی افزایش می دهد.
  • مونتاژ PCR برای بهبود بازده پروتئین مورد نظر استفاده می شود و همچنین می توان از آن برای تولید مقادیر زیادی RNA برای مطالعات ساختاری یا بیوشیمیایی استفاده کرد.

 

  1. Asymmetric PCR
  • Asymmetric PCR نوعی از PCR است که برای تقویت ترجیحی یک رشته از DNA اصلی بیش از دیگری استفاده می شود.
  • تفاوت PCR نامتقارن با PCR معمولی با مقدار بیش از حد پرایمر برای یک رشته انتخابی.
  • همانطور که PCR نامتقارن پیشرفت می کند، پرایمر محدود کننده غلظت کمتر از نظر کمی در DNA دو رشته ای جدید ساخته شده و استفاده می شود.
  • در نتیجه، سنتز خطی تک رشته DNA هدف از پرایمر اضافی پس از تخلیه پرایمر محدود کننده تشکیل می شود.
  • زمانی مفید است که تقویت تنها یکی از دو رشته مکمل مورد نیاز باشد، مانند توالی یابی و کاوشگر هیبریداسیون.

 

  1. COLD PCR
  • تکثیر همزمان در واکنش زنجیره ای پلیمراز مبتنی بر دمای دناتوراسیون پایین (COLD-PCR) یک شکل جدید از PCR است که به طور انتخابی واریانت های DNA با فراوانی کم را از مخلوط توالی های نوع وحشی و حاوی جهش (یا حاوی گونه) تکثیر می کند. از نوع جهش یا موقعیت روی آمپلیکون.
  • این روش بر اساس تغییر دمای بحرانی است که در آن DNA حاوی جهش ترجیحاً نسبت به نوع شدید ذوب می شود.
  • یک فرآیند اتصال میانی پس از دناتوراسیون وجود دارد که امکان هیبریداسیون را فراهم می کند. این عدم تطابق کمی دمای ذوب DNA ds را تغییر می دهد.
  • این هترودپلکس ها ذوب می شوند و به عنوان یک الگو استفاده می شوند. در نتیجه، بخش قابل توجهی از DNA واریانت جزئی تکثیر شده و برای دورهای بعدی PCR در دسترس خواهد بود.
  • PCR نقش حیاتی در تشخیص جهش در نمونه های انکولوژی، به ویژه در تومورهای ناهمگن و همچنین مایعات بدن دارد.
  • این PCR همچنین به ارزیابی بیماری باقیمانده پس از جراحی یا شیمی درمانی و مرحله بندی بیماری و پروفایل مولکولی برای پیش آگهی یا مناسب سازی درمان برای بیماران فردی کمک می کند.

 

  1. Colony PCR
  • Colony PCR روشی است که در آن شناسایی DNA مورد علاقه وارد شده به پلاسمید با طراحی پرایمرهای اختصاصی DNA وارد شده به دست می آید.
  • کلنی باکتری حاوی پلاسمید را می توان مستقیماً با استفاده از دو مجموعه پرایمر تقویت کرد.
  • اولین مجموعه از پرایمرهای اختصاصی درج است که توالی درج را تقویت می کند، و دیگری از آغازگرهای جانبی ویژه بردار است که DNA پلاسمید را به غیر از DNA وارد شده تقویت می کند.
  • یک کلنی باکتری گرفته می شود و مستقیماً به مخلوط اصلی حاوی سایر معرف های PCR اضافه می شود.
  • کاربرد اصلی کلنی PCR در شناسایی بستن صحیح و قرار دادن DNA وارد شده به باکتری و همچنین پلاسمید مخمر است.
مشاهده
انواع انژکتورهای کروماتوگرافی گازی (دستگاه GC)-(فصل 4)

 

  1. Conventional PCR
  • واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک سیستم لوله آزمایشی برای همانندسازی DNA است که به یک توالی DNA “هدف” اجازه می دهد تا به طور انتخابی چندین میلیون برابر تنها در چند ساعت تقویت شود.
  • PCR سنتز قطعات خاص DNA را با استفاده از آنزیم DNA-پلیمراز، که در تکثیر ماده ژنتیکی سلولی شرکت می کند، امکان پذیر می کند.
  • این آنزیم یک توالی مکمل از DNA را سنتز می کند، زیرا یک قطعه کوچک (پرایمر) به یکی از رشته های DNA در محل خاصی که برای شروع سنتز انتخاب شده است متصل می شود.
  • پرایمرها توالی مورد تکرار را محدود می کنند و نتیجه تکثیر یک توالی DNA خاص با میلیاردها نسخه است.
  • PCR معمولی در جداسازی انتخابی DNA، تکثیر و تعیین کمیت DNA، رویکردهای پزشکی و تشخیصی، تشخیص بیماری های عفونی، مطالعات پزشکی قانونی و زمینه های تحقیقاتی استفاده می شود.

 

  1. Digital PCR (dPCR)
  • دیجیتال PCR (dPCR) یک فناوری کمی PCR است که روشی حساس و کارآمد برای اندازه‌گیری مقدار DNA یا RNA موجود در یک نمونه فراهم می‌کند.
  • برای dPCR، مخلوط نمونه اولیه قبل از مرحله تقویت به تعداد زیادی چاهک جداگانه تقسیم می‌شود که در نتیجه توالی هدف در هر چاه وجود دارد یا خیر.
  • بر اساس وجود یا عدم وجود فلورسانس در چاه های واکنش تقویت شده، محاسبه تعداد مطلق اهداف موجود در نمونه اصلی انجام می شود.
  • چاه های دارای سیگنال فلورسنت مثبت در نظر گرفته می شوند و امتیاز “1” دارند در حالی که چاه هایی که چنین سیگنالی ندارند منفی هستند و نمره “0” می گیرند.
  • سپس غلظت توالی هدف موجود در نمونه اولیه از طریق تجزیه و تحلیل آماری پواسون تعیین می شود.
  • dPCR برای تعیین تعداد کل ویروس‌ها، باکتری‌ها و انگل‌های DNA و RNA در انواع نمونه‌های بالینی، عمدتاً زمانی که یک استاندارد خوب کالیبره شده در دسترس نباشد، استفاده می‌شود.

 

  1. Fast-cycling PCR
  • Fast cycling PCR یک فناوری مبتنی بر PCR است که امکان تقویت محصولات خاص PCR را با کاهش قابل توجه زمان چرخه انجام می دهد.
  • اصل در این فرآیند همانند PCR معمولی است و تنها تفاوت آن زمان تقویت است.
  • بافر مورد استفاده در این PCR میل ترکیبی Taq DNA پلیمرازها را برای قطعات DNA تک رشته ای کوتاه افزایش می دهد و زمان لازم برای بازپخت موفقیت آمیز پرایمر را به تنها 5 ثانیه کاهش می دهد.
  • چرخه سریع PCR برای فرآیندهایی که نیاز به چرخه سریع دارند ضروری است و همچنین به تشخیص سریع بیماری ها و جهش ها کمک می کند.

 

  1. High-fidelity PCR
  •   یک روش PCR اصلاح‌شده است که از یک DNA پلیمراز با نرخ خطای کم استفاده می‌کند و منجر به درجه بالایی از دقت در همانندسازی DNA مورد نظر می‌شود.
  • چنین آنزیم هایی میل اتصال قابل توجهی برای نوکلئوزید تری فسفات صحیح در طول تقویت دارند.
  • در صورت اتصال نادرست در سایت فعال پلیمراز، ادغام به دلیل معماری مجموعه سایت فعال کند می شود.
  • تقویت High-fidelity PCR برای آزمایش‌هایی ضروری است که نتیجه آنها به توالی DNA صحیح مانند شبیه‌سازی، تجزیه و تحلیل SNP و کاربردهای NGS بستگی دارد.

 

  1. High-Resolution Melt (HRM) PC
  • این یک تکنیک بسیار قدرتمند برای تشخیص جهش ها، پلی مورفیسم ها و تفاوت های اپی ژنتیکی در DNA دو رشته ای است.
    نمونه ها.
  • در مقایسه با سایر فن آوری های ژنوتیپ مانند توالی یابی و تایپ SNP Taqman بسیار مقرون به صرفه است. این آن را برای پروژه های ژنوتیپ در مقیاس بزرگ ایده آل می کند.
  • این سریع و قدرتمند است بنابراین قادر است تعداد زیادی از نمونه ها را به دقت ژنوتیپ کند.
  • آسان است. با استفاده از روش HRM با کیفیت خوب، ژنوتیپ قدرتمندی را می توان توسط متخصصان غیر ژنتیک در هر آزمایشگاهی با دسترسی به دستگاه PCR بلادرنگ با قابلیت HRM انجام داد.

 

  1. Hot start PCR
  • Hot start PCR شکل جدیدی از واکنش زنجیره ای پلیمراز معمولی (PCR) است که به دلیل تقویت غیر اختصاصی DNA در دمای اتاق، بروز محصولات نامطلوب و تشکیل پرایمر-دایمرها را کاهش می دهد.
  • اصل اساسی PCR شروع داغ جداسازی یک یا چند معرف از مخلوط واکنش است تا زمانی که مخلوط پس از حرارت دادن به دمای دناتوراسیون برسد.
  • Hot start PCR به طور قابل توجهی اتصال غیر اختصاصی، تشکیل پرایمر-دایمرها را کاهش می دهد و اغلب بازده محصول را افزایش می دهد. همچنین به تلاش کمتری نیاز دارد و خطر آلودگی را کاهش می دهد.

 

  1. In situ PCR
  • واکنش زنجیره‌ای پلیمراز درجا (In-situ PCR) روشی مؤثر است که مقادیر کمی از توالی‌های اسید نوکلئیک نادر را در سلول‌ها یا بخش‌های بافتی منجمد یا جاسازی‌شده در پارافین برای تقسیم‌بندی آن توالی‌ها در سلول‌ها تشخیص می‌دهد.
  • این روش شامل تثبیت بافتی است که مورفولوژی سلولی را حفظ می‌کند، که سپس با درمان با آنزیم‌های پروتئولیتیک دنبال می‌شود تا ورود واکنش‌های PCR به DNA هدف ارائه شود.
  • توالی های هدف توسط معرف ها تقویت شده و سپس توسط پروتکل های ایمونوسیتوشیمی استاندارد شناسایی می شوند.
  • PCR در محل برای تشخیص بیماری‌های عفونی، تعیین کمیت DNA، تشخیص حتی مقدار کمی از DNA کاربرد دارد و به طور گسترده در مطالعه ارگانوژنز و جنین‌زایی استفاده می‌شود.

 

  1. Intersequence specific (ISS) PCR
  • InterSequence-Specific PCR (یا ISSR-PCR) روشی برای انگشت نگاری DNA است که از پرایمرهای انتخاب شده از بخش های خاص تکرار شده در سراسر ژنوم برای تولید اثر انگشت منحصر به فرد استفاده می کند.
  • در این تکنیک از ریزماهواره ها، معمولاً 16 استفاده می شود–به طول 25 جفت باز، به عنوان پرایمرهای یک واکنش PCR پرایمری که چندین مکان ژنومی را هدف قرار می دهد تا عمدتاً توالی های بین SSR در اندازه های مختلف را تقویت کند.
  • ISSR PCR را می توان در انگشت نگاری ژنومی، تنوع ژنتیکی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک، نقشه برداری ژنوم و برچسب گذاری ژن استفاده کرد.

 

  1. Inverse PCR
  • واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس (Inverse PCR) یکی از انواع مختلف واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای تقویت DNA در زمانی که تنها یک توالی شناخته شده است استفاده می شود.
  • PCR معمولی به پرایمرهای مکمل برای هر دو پایانه DNA هدف نیاز دارد، اما PCR معکوس اجازه می‌دهد حتی اگر فقط یک توالی در دسترس باشد که پرایمرها از آن طراحی شوند، انجام شود.
  • PCR معکوس شامل یک سری هضم محدود و به دنبال آن بستن می‌شود که منجر به یک قطعه حلقه‌ای می‌شود که سپس می‌تواند از طریق یک بخش منفرد از توالی شناخته شده برای PCR آماده شود.
  • سپس، مانند سایر فرآیندهای واکنش زنجیره ای پلیمراز، DNA توسط DNA پلیمراز حساس به دما تقویت می شود.
  • PCR معکوس به ویژه برای تعیین مکان های درج ترانسپوزون ها و رتروویروس های مختلف در DNA میزبان مفید است.

 

  1. LATE (linear after the exponential) PCR
  • LATE (Linear-After-The-Exponential) PCR اصلاحی از PCR نامتقارن است که از یک پرایمر محدود کننده با دمای ذوب بالاتر از پرایمر اضافی استفاده می کند که کارایی واکنش را حفظ می کند زیرا غلظت پرایمر محدود کننده در اواسط واکنش کاهش می یابد.
  • LATE-PCR با یک فاز نمایی شروع می شود که در آن راندمان تقویت مشابه با PCR معمولی است. هنگامی که پرایمر محدود کننده تخلیه شد، واکنش به طور ناگهانی به تقویت خطی تغییر می کند و محصول تک رشته ای برای بسیاری از چرخه های حرارتی اضافی ادامه می یابد.

 

  1. Ligation-mediated PCR
  • PCR با واسطه بستن یک شکل اصلاح شده از PCR معمولی است که در ابتدا تنها با آگاهی از یک انتها و سپس افزودن انتهای دوم با بستن یک پیوند دهنده DNA منحصر به فرد امکان پذیر است.
  • PCR با واسطه بستن از قطعات کوچک DNA به نام “لینکرها” (یا آداپتورها) استفاده می کند که در ابتدا به قطعات DNA هدف متصل می شوند.
  • پرایمرهای PCR که برای اتصال به توالی های پیوند دهنده طراحی شده اند، سپس برای تقویت قطعات هدف استفاده می شوند.
  • این روش برای تعیین توالی DNA، راه رفتن ژنوم و ردپای DNA به کار می رود.

 

  1. Long-range PCR
  • Long-range PCR روشی برای تکثیر طول‌های DNA طولانی‌تر است که معمولاً با استفاده از روش‌ها یا معرف‌های معمول PCR نمی‌توان آن را تقویت کرد.
  • PCR دوربرد را می توان با استفاده از پلیمرازهای با کارایی بالا اصلاح شده با اتصال DNA تقویت شده، که منجر به تکثیر بسیار پردازشی و دقیق قطعات طولانی می شود، به دست آورد.
  • این روش امکان تقویت اهداف گسترده تر را در مدت زمان کوتاه تر و با استفاده کارآمد از منابع فراهم می کند.

 

  1. Methylation-specific PCR (MSP)
  • PCR اختصاصی متیلاسیون (MSP) روشی برای تشخیص و آنالیز الگوهای متیلاسیون DNA در جزایر CpG است.
  • برای انجام MSP، DNA توسط اصلاح شده و PCR با دو جفت پرایمر انجام می شود که به ترتیب DNA متیله و غیر متیله قابل تشخیص هستند.
  • DNA برای تبدیل سیتوزین به اوراسیل تحت درمان با بی سولفیت قرار می گیرد و سپس توالی های متیله به طور انتخابی با آغازگرهای مخصوص تکثیر می شوند.
  • تشخیص الگوهای متیله ضروری است زیرا متیلاسیون بیش از حد دی نوکلئوتیدهای CpG در پروموتر بیان ژن را سرکوب می کند.

 

  1. Miniprimer PCR
  • یک روش جدید PCR با استفاده از یک پلیمراز مهندسی شده و “مینی پرایمرهای” 10 نوکلئوتیدی، Miniprimer PCR نامیده می شود.
  • این روش برای نشان دادن توالی‌های جدید ژن 16S rRNA که با آغازگرهای استاندارد شناسایی نمی‌شدند، یافت شد.
  • Miniprimer PCR از یک آنزیم پلیمراز مقاوم در برابر حرارت استفاده می کند که می تواند از پرایمرهای کوتاه (9 یا 10 نوکلئوتید) گسترش یابد.
  • این روش اجازه می دهد تا PCR را به نواحی اتصال پرایمر کوچکتر هدف قرار دهد، و برای تقویت توالی های DNA بسیار حفاظت شده، مانند ژن rRNA 16S (یا یوکاریوتی 18S) استفاده می شود.

 

  1. Multiplex PCR
  • Multiplex PCR یک تکنیک متداول بیولوژی مولکولی است که برای تقویت چندین هدف در یک آزمایش PCR استفاده می شود.
  • در Multiplex PCR، پرایمرهای متعدد و یک DNA پلیمراز با واسطه دما برای تکثیر DNA در یک سیکلر حرارتی استفاده می شود.
  • تمام جفت های پرایمرهای طراحی شده برای Multiplex PCR باید بهینه شوند تا دمای بازپخت یکسان برای همه جفت ها در طول PCR بهینه باشد.
  • هنگامی که چندین توالی به طور همزمان مورد هدف قرار می گیرند، اطلاعات اضافی را می توان از یک آزمایش واحد تولید کرد که در غیر این صورت به مقدار بیشتری از معرف ها و زمان و تلاش گسترده برای انجام نیاز دارد.
  • این فناوری در بسیاری از زمینه ها مانند ژنوتیپ، تجزیه و تحلیل جهش و پلی مورفیسم، تجزیه و تحلیل STR ریزماهواره، تشخیص پاتوژن ها یا ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی و غیره استفاده شده است.
  • در آزمایشگاه‌های تشخیصی، Multiplex PCR برای شناسایی میکروارگانیسم‌های مختلف که باعث بیماری‌های مشابه می‌شوند مفید است.
مشاهده
چگونه از کروماتوگرافی گازی (GC) برای اکتشاف نفت استفاده می شود؟

 

  1. Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR)
  • یک PCR مرتبط با نانوذرات شامل مواد مولکولی کوچکی است که دارای خواص فیزیکی خاصی است که واکنش را تقویت می‌کند.
  • یکی از تئوری‌های مربوط به نانوذرات طلا بیان می‌کند که این ذرات مقداری از پلیمراز را جذب می‌کنند و مقدار پلیمراز باقی‌مانده در سیستم را مدیریت می‌کنند که ممکن است برای افزایش ویژگی واکنش ضروری باشد.
  • نظریه دیگری توضیح می دهد که آنها جفت آغازگر را جذب می کنند و دمای ذوب را در شکل گیری دوبلکس بین آغازگرهای کاملاً جفت شده و نادرست کاهش می دهند، که منجر به افزایش ویژگی واکنش می شود.
  • PCR مرتبط با نانوذرات دارای مزایای حساسیت بالا، ویژگی بالا و گزینش پذیری بالا است و به طور گسترده در تشخیص ویروس و تعیین توالی ژن استفاده شده است.

 

  1. Nested PCR
  • Nested PCR یک اصلاح مفید در فناوری PCR است که در آن ویژگی واکنش با جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی با کمک دو مجموعه پرایمر افزایش می‌یابد.
  • اولین مجموعه پرایمر به خارج از DNA هدف ما متصل می شود و قطعه بزرگتر را تقویت می کند در حالی که مجموعه دیگری از پرایمر به طور خاص در محل هدف متصل می شود.
  • در دور دوم تقویت، مجموعه دوم پرایمر تنها DNA هدف را تقویت می کند.
  • Nested PCR روشی مفید برای مطالعات فیلوژنتیکی و تشخیص پاتوژن های مختلف است.
  • این تکنیک حساسیت بالاتری دارد. از این رو حتی اگر نمونه حاوی DNA کمتری باشد، می توان آن را تقویت کرد که در روش PCR معمولی امکان پذیر نیست.

 

  1. Overlap extension PCR (OE-PCR)
  • به این روش “Splicing by Overlap Extension” یا SOEing نیز می گویند.
  • Overlap extension PCR یک تکنیک ارزشمند است که معمولاً برای شبیه‌سازی قطعات پیچیده بزرگ، ویرایش ژن‌های شبیه‌سازی شده یا ترکیب دو عنصر ژن با هم استفاده می‌شود.
  • از قطعات کوتاهتر قطعات DNA بلندتر ایجاد می کند.
  • این برای شبیه‌سازی کارآمد ژن و قرار دادن، حذف و جایگزینی قطعات بزرگ چندگانه استفاده می‌شود.
  • ثابت شده است که برای جهش زایی مستقیم، ایجاد مولکول های کایمریک یا حتی شبیه سازی بخش های ژنی بزرگ با اتصال قطعات کوچکتر به هم مفید است.

 

  1. Real-Time PCR (Quantitative PCR (qPCR))
  • PCR کمی (qPCR)، همچنین به نام Real-Time PCR یا Quantitative Real-time PCR، یک تکنیک مبتنی بر PCR است که تقویت یک توالی DNA هدف را با کمی سازی غلظت آن گونه DNA در واکنش جفت می کند.
  • PCR معمولی فرآیندی زمان‌بر است که در آن محصولات PCR از طریق الکتروفورز ژل آنالیز می‌شوند. qPCR با ارائه تشخیص زمان واقعی محصولات در مرحله نمایی، تجزیه و تحلیل را تسهیل می کند.
  • اصل Real-time PCR به استفاده از رنگ فلورسنت بستگی دارد.
  • غلظت اسید نوکلئیک موجود در نمونه با استفاده از رنگ فلورسنت یا با استفاده از الیگونوکلئوتیدهای نشاندار فلورسنت تعیین می شود.
  • q-PCR در ژنوتیپ و تعیین کمیت پاتوژن ها، تجزیه و تحلیل microRNA، تشخیص سرطان، آزمایش بار میکروبی و تشخیص GMOs استفاده می شود.

 

  1. Repetitive sequence-based PCR
  • Repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) یک فناوری PCR اصلاح شده است که از پرایمرهایی استفاده می کند که توالی های تکراری غیرکدکننده را که در سراسر ژنوم باکتری پراکنده شده اند، هدف قرار می دهد.
  • چنین بلوک‌هایی از توالی‌های غیرکدکننده و تکراری می‌توانند به‌عنوان اهداف ژنتیکی متعدد برای پروب‌های الیگونوکلئوتیدی عمل کنند و امکان تولید پروفایل‌های DNA یا اثرانگشت منحصربه‌فرد برای سویه‌های باکتریایی را فراهم کنند.
  • کاربرد اصلی rep-PCR در تایپ کردن سویه مولکولی باکتری های مختلف است. همچنین برای تشخیص اپیدمیولوژیک پاتوژن های مختلف استفاده می شود.

 

  1. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
  • PCR رونویسی معکوس (RT-PCR) اصلاحی در PCR معمولی است که به موجب آن مولکول‌های RNA ابتدا به مولکول‌های DNA مکمل (cDNA) تبدیل می‌شوند که سپس می‌توانند توسط PCR تقویت شوند.
  • در RT-PCR، ابتدا الگوی RNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس به DNA مکمل (cDNA) تبدیل می شود. سپس cDNA به عنوان یک الگو برای تقویت نمایی با استفاده از PCR عمل می کند.
  • RT-PCR را می توان در یک لوله یا دو مرحله در لوله های مختلف انجام داد. روش تک مرحله ای با احتمال کمتر آلودگی و ادغام تغییرات موثرتر است.
  • RT-PCR در روش های تحقیق، درج ژن، تشخیص بیماری های ژنتیکی و تشخیص سرطان استفاده می شود.

 

  1. Reverse-Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR)
  • RT-PCR معمولاً با q-PCR تشکیل دهنده Reverse Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR) همراه است.
  • این امکان کمی سازی DNA را در زمان واقعی پس از تقویت می دهد.

 

  1. PCR وابسته به RNase H
  • در PCR وابسته به RNase H، پرایمرها حاوی یک بلوک تقویت قابل جابجایی در انتهای 3′ خود هستند.
  • پرایمر مسدود شده تنها می تواند بسته به فعالیت برش یک آنزیم RNase در طول هیبریداسیون به دنباله هدف مکمل، تقویت را انجام دهد.
  • آنزیم RNase H دارای فعالیت آنزیمی بسیار کمی در دمای پایین است و شروع گرم را بدون هیچ تغییری در DNA پلیمراز امکان پذیر می کند.
  • به طور مشابه، بازده برش آنزیم در حضور عدم تطابق در نزدیکی باقی مانده RNA کاهش می یابد.
  • بنابراین، تحت فعالیت آنزیم RNase H، اتصال غیر اختصاصی و تشکیل دایمر آغازگر کاهش می‌یابد و هیبریداسیون مؤثر را ممکن می‌سازد.

 

  1. Single Specific Primer PCR
  • تک پرایمر-PCR (SSP-PCR) یک فناوری مبتنی بر PCR است که امکان تکثیر ژن‌هایی را می‌دهد که تنها بخشی از اطلاعات توالی جزئی آن در دسترس است.
  • این اجازه می دهد تا ژنوم یک طرفه از مناطق شناخته شده کروموزوم به سمت ناشناخته حرکت کند.

 

  1. Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR)
  • این امکان تقویت DNA دو رشته ای را حتی زمانی که اطلاعات توالی فقط در یک انتها در دسترس باشد، می دهد.
  • این روش، تک پرایمر-PCR (SSP-PCR)، تکثیر ژن‌هایی را که فقط اطلاعات توالی جزئی برای آن‌ها در دسترس است، اجازه می‌دهد و اجازه می‌دهد ژنوم یک طرفه از مناطق شناخته شده کروموزوم به سمت ناشناخته حرکت کند.

 

  1. Solid phase PCR
  •  Solid phase PCR (SP-PCR) یک تکنیک PCR منحصر به فرد است که اجازه می دهد تا اسیدهای نوکلئیک هدف را بر روی یک تکیه گاه جامد که در آن یک یا هر دو پرایمر روی سطح بی حرکت هستند، تقویت شود.
  • جداسازی فضایی پرایمرها برهمکنش‌های نامطلوب پرایمر را به حداقل می‌رساند، در نتیجه از تشکیل پرایمر-دایمرها جلوگیری می‌کند و امکان تقویت مالتی پلکس بالاتر را فراهم می‌کند.
  • ایده اصلی این روش جدید، اتصال انتهای 5′ پرایمرها به یک سطح است به جای اینکه پرایمرها آزادانه در یک محلول توده پخش شوند.
  • یک هدف DNA که آزادانه منتشر می شود را می توان روی سطح گرفت و سپس توسط پلیمراز کپی کرد.
  • کپی به سطح چسبیده می ماند، در حالی که مولکول DNA اولیه پس از مرحله بازپخت به محلول باز می گردد.
  • انتهای آزاد کپی پیوست شده به پرایمر (چسب شده به سطح) مکمل توالی آن هیبرید می شود و فرآیند تقویت می تواند آغاز شود.

 

  1. Suicide PCR
  • معمولاً در مطالعاتی استفاده می شود که در آن اجتناب از مثبت کاذب و اطمینان از اختصاصی بودن قطعه تقویت شده بالاترین اولویت است.
  • این روش مستلزم استفاده از هر ترکیب پرایمر تنها یک بار در PCR است که نباید در هیچ واکنش PCR کنترل مثبت استفاده می‌شد.
  • این آغازگرها همیشه باید ناحیه ژنومی را هدف قرار دهند که هرگز قبل از استفاده از این پرایمر خاص یا هر مجموعه پرایمر دیگری تقویت نشده است.
  • این ترتیب تضمین می‌کند که هیچ DNA آلوده‌کننده‌ای از واکنش‌های قبلی PCR در آزمایشگاه وجود ندارد، که در غیر این صورت می‌تواند نتایج مثبت کاذب ایجاد کند.
  • Suicide PCR در مطالعات دیرینه‌شناسی که شامل بررسی مواد ژنتیکی حفظ شده از بقایای موجودات باستانی است، استفاده می‌شود.

 

  1. Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)
  • TAIL PCR یک ابزار قدرتمند برای بازیابی قطعات DNA در مجاورت توالی های شناخته شده است.
  • TAIL PCR از سه پرایمر تو در تو در واکنش‌های متوالی همراه با یک پرایمر دژنره دلخواه با دمای ذوب پایین استفاده می‌کند تا فرکانس‌های تقویت نسبی محصولات خاص و غیر اختصاصی را بتوان از نظر حرارتی کنترل کرد.
  • این روش بسیار دقیق است به طوری که محصولات TAIL-PCR خالص نشده را می توان مستقیماً توالی یابی کرد.
  • همچنین امکان شبیه سازی ژن های عملکردی تمام قد را فراهم می کند.

 

  1. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR
  • Touch Down PCR اصلاحی در PCR است که در آن دمای بازپخت اولیه بالاتر از Tm بهینه پرایمرها است و به تدریج در چرخه های بعدی تا رسیدن به دمای Tm یا “دمای تاچ داون” کاهش می یابد.
  • Touchdown PCR ویژگی واکنش را در دماهای بالاتر افزایش می دهد و با کاهش دمای بازپخت راندمان را تا انتها افزایش می دهد.

 

  1. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR
  • آنها نشانگرهای مهمی برای فردی شدن در علم پزشکی قانونی هستند.
  • در VNTR PCR، قطعاتی تکثیر می‌شوند که تنوع کمی را در یک گونه نشان می‌دهند، اما تفاوت‌هایی را بین گونه‌ها نشان می‌دهند.
  • این می تواند با موفقیت از مقدار بسیار کمی اسید دئوکسی ریبونوکلئیک ژنومی (DNA) توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکثیر شود.
  • در میان ابزارهای ژنوتیپ، آنالیز تکرار پشت سر هم با تعداد متغیر مبتنی بر PCR (VNTR) یک روش امیدوارکننده برای تایپ M. tuberculosis نشان داد.

 

 

جهت مشاوره و خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی با مشاوران واحد فروش شرکت شناسا پرتوژن ۷۵۳۱۱ – ۰۲۱ در ارتباط باشید.

بدون دیدگاه
اشتراک گذاری
اشتراک‌گذاری
با استفاده از روش‌های زیر می‌توانید این صفحه را با دوستان خود به اشتراک بگذارید.